第三章核酸化学2010b.ppt

2. SDS蛋白酶K－DNA萃取：为了得到大分子DNA避免核酸酶和机械振荡对DNA的降解，在细胞悬液中直接加入SDS的缓冲溶液，并加入广谱蛋白酶（如蛋白酶K) ，蛋白质全部降解，然后用苯酚抽提，除净蛋白酶和蛋白质的部分降解产物。DNA制品中的少量RNA可用纯的RNase分解除去。（EDTA等鳌合剂或SDS等去垢剂不能使蛋白酶K失活，反而增强和稳定酶活性。 ） 3. 氯化铯密度梯度离心（cesium chloride density gradient centrifugation） DNA分离纯化 （二）、RNA的制备 RNA比DNA更不稳定，而且RNase又无处不在，因此RNA的分离更为困难。制备RNA通常需要注意3点： ① 所有用于制备RNA的玻璃器皿都要经过高温焙烤，塑料用具经过高压灭菌，不能高压灭菌的用具要用0.196焦碳酸二乙酯（DEPC）处理，再煮沸以除净DEPC。 DEPC能使蛋白质乙基化而破坏RNase活性。 ② 在破碎细胞的同时加入强变性剂（如胍盐）使RNase失活。 ③ 在RNA的反应体系内加入RNase的抑制剂（如RNasin) 。 RNA的制备 目前最常用的制备RNA方法有两个： 其一，用酸性胍盐／苯酚／氯仿抽提。 异硫氰酸胍是极强烈的蛋白质变性剂，它几乎使所有遇到的蛋白质都被变性。然后用苯酚和氯仿多次除净蛋白质。此法用于小量制备RNA。 其二，用胍盐／氯化铯将细胞抽提物进行密度梯度离心。蛋白质密度 1.33 g/cm3,在最上层。DNA密度在1.71 g/cm3左右，位于中间。RNA密度 1.89 g/cm3，沉在底部。用此方法可制备较大量高纯度的天然RNA。 ★ mRNA的制备：oligo(dT)纤维素亲合层析 （三）、核酸的定量测定 1、紫外分光光度法 2、定磷法：钼蓝比色法 核酸分子中的有机磷经强酸消化后形成无机磷，在酸性条件下,无机磷与钼酸铵结合形成黄色磷钼酸铵沉淀，在还原剂存在的情况下,黄色物质变成蓝黑色,称为钼蓝。在一定浓度范围内，蓝色的深浅与磷含量成正比，可用比色法测定。若样品中尚含有无机磷，需作对照测定，消除无机磷的影响，以提高准确性。 钼蓝最大的光吸收在650—660nm波长处 福林-酚法测定蛋白质的原理 该方法是双缩脲法的发展，包括两步反应： (1) 在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质—铜络合物。 (2) 此络合物将试剂磷钼酸—磷钨酸(ＦolIn试剂)还原，混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物)，颜色深浅与蛋白质含量成正比。此方法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100倍，定量范围为5～100μg蛋白质。ＦolIn试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物，均有干扰作用。 核酸的定量 3、定糖法 A670, A595 二苯胺 地衣酚 二、核酸的沉降特性与超速离心 不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA与蛋白质区分开来。这一方法常用于质粒DNA的纯化。 RNA＞DNA 变性DNA＞双链DNA ＞蛋白质， 变性程度越大，浮力密度越大 密度 核酸的沉降特性与超速离心的应用 （一）密度梯度超速离心测定核酸的浮力密度： 8M CsCl，45000rpm，16h 密度梯度：1.80g/ml→1.55g/ml 平衡时：浮力密度=CsCl密度=离心力 ρ=ρ0 +4.2ω2（r2 - r02） × 10-10 （二）密度梯度超速离心测定DNA的G-C含量 G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系 ρ=0.1 xG-C + 1.658 xG-C = （ ρ-1.658）× 10 但是5-甲基胞嘧啶多的DNA，其实际浮力密度会降低，低于理论值。 核酸的沉降特性与超速离心的应用 （三）密度梯度超速离心研究核酸的构象 （四）密度梯度超速离心纯化 RNA或不同构象的DNA 超螺旋DNA或 三、? 核酸的凝胶电泳 （一）、?? 琼脂糖电泳 用于大片段DNA的分离，精度低，但分离范围广 ★琼脂糖电泳可以用于DNA分子量的测定 ★琼脂糖电泳可以用于DNA的制备与纯化 （二）、 PAGE电泳 用于小片段DNA的分析，精度非常高 Polyacrylamide (聚丙稀酰胺) can resolve DNA/RNA that diffe