第三章基因工程制药2011-101.ppt

传统制药存在的问题 A.材料来源困难或制造技术问题而无法付诸应用; B.从动物脏器中提取出来,也因造价太高,或因来源困难而供不应求; C.由于免疫抗原等缘故,使它们在使用上受到限制 基因工程药物的研究开发状况 命名： 第一个字母（大写, 斜体）： 该酶来源的微生物属名； 第二、三个字母（小写、斜体）：微生物种名； 若该微生物有不同的变种和品系，再加上该变种和品系的第一个字母（大写） 若从同一微生物发现多种限制性内切酶，则依照发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。 分 类 Ⅰ 型限制性内切酶 Ⅱ 型限制性内切酶 Ⅲ 型限制性内切酶 Ⅱ型限制性内切酶 识别并特异切割DNA分子。 识别长度为4-8个核苷酸的特异序列； 许多识别序列具回文结构，如Hind Ⅲ 的识别序列： 5` AAGCTT 3` 3` TTCGAA 5 切割产生末端有粘端 (cohesive/sticky end) 如BamH I (G↓GATCC) 和平端 (blunt end) 如Sma I (CCC ↓GGG) 异源同工酶(isoschizomer) 来源不同但能识别和切割同一位点的酶。又称同裂酶。 如：BamH I (G↓GATCC)和Bst I (G ↓GATCC) 限制性内切酶反应的影响因素 ① DNA模板的纯度 ② DNA的甲基化程度 ③ 酶切反应温度 ④ DNA的分子结构 ⑤ 缓冲液 2 DNA连接酶 3 聚合酶（DNA polymerase） DNA聚合酶 Ⅰ 5`→3`聚合活性，5`→3`外切和3`→5` 外切活性。 反转录酶 2.载体 理想的基因工程载体一般至少有以下几点要求： 能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力。 容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。 容易插入目的基因，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点。 容易从宿主细胞中分离纯化出来。 有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。这才介于克隆操作。 1.化学合成法 2. PCR法 3.基因文库法 4. cDNA文库法 2).PCR法：可以在体外特异性地扩增目的基因片段，并可以在设计引物时引入合适的酶切位点和标签结构，是目前实验室常用的目的基因制备法。 3).基因文库法：将生物体全部基因组通过酶切分成不同DNA片断，与载体连接，构成重组子，转化宿主细胞，从而形成生物体全部基因组DNA片断的克隆。 4).cDNA文库法 cDNA是指与mRNA互补的DNA。 cDNA文库法是指提取生物体总mRNA，并以mRNA作为模板，反转录酶催化合成cDNA，将全部的cDNA都克隆至宿主细胞而构建cDNA文库。 1）重组DNA导入大肠杆菌 磷酸钙沉淀法：溶解的DNA 加Na2HPO4和CaCl2 形成磷酸钙沉淀， DNA被包在磷酸钙沉淀中，形成DNA—磷酸钙共沉淀物，当和细胞表面接触时，则通过细胞吞噬作用而将DNA导入。 该方法简单，可以进行共转化，但不太适合悬浮细胞的转染。 电穿孔法： 借助电穿孔仪的高压脉冲电场， 使细胞膜出现瞬时可逆性小孔， 外源DNA沿小孔进入细胞。 该方法转化率较高，拷贝数低，适合于悬浮细胞。 融合型表达的优缺点： 优点： 1．稳定性强 2．比单纯分泌表达产量高 缺点：1．需将融合蛋白两者分开，对酶切试剂和工艺的要求高 2．可能面临体外复性问题 分泌型表达的优缺点 优点：1 可溶性表达 2 可能接近天然构象 3 Met可被切除 缺点：1 表达量低 2 纯化较困难 3 面临复性问题 ⑵昆虫细胞表达系统 优点： 可以表达较大的外源基因，可以同时表达多个外源基因。 可以实现不同生物来源的外源基因的表达 蛋白质翻译后加工（肽剪切糖基化）功能与高等生物相似，外源蛋白保持天然生物活性。 生物安全性高 ⑶哺乳动物细胞 优点：表达产物可由重组转化细胞分泌到培养液中，纯化容易。产物是糖基化的接近天然物。 缺点：生长慢，生产率低，培养条件苛刻，费用高，培养液浓度稀。 ⑴离子交换层析（ ion exchange chromatography IEC） 基本原理:通过带电的蛋白质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换，从而达到分离纯化的目的。 它具有分辨率高、容量大、操作容易，该法已成为多肽蛋白质核酸分离纯化的重要方法。 2.亲和层析（affinity hromatography，AC） 亲和层析