第二十一章常用分子生物学技术的原理及应用-lt.pptVIP

第二十一章 常用分子生物学技术的原理及应用 The popular technology in molecular biology: principle and application 第 一 节分子杂交与印迹技术Molecular hybridization  blotting technology （一）Southern blotting Northern blotting　结果 蛋白质的转移只有靠电转移。 蛋白质的检测以抗体作探针。 用碱性磷酸酶（ALP）、辣根过氧化酶（HRP）标记第二抗体，底物显色来检测蛋白区带的信号，底物亦可与化学发光剂结合以提高敏感度。 或用同位素标记第二抗体，放射自显影法检测蛋白区带的信号。 第 二 节 PCR技术的原理与应用 三、几种重要的PCR衍生技术 （一）反转录PCR技术 (RT-PCR) （二）原位PCR技术 (ISP) （三）实时PCR技术 (real time PCR) 第 三 节核 酸 序 列 分 析Nucleic acid sequence analysis PE 3700型DNA测序仪 DNA序列测定(双脱氧法) 基 因 文 库Gene Library 第 七 节遗传修饰动物模型的建立及应用 核转移技术 即动物整体克隆技术，将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的卵细胞内，使之发育成个体，即克隆(clone)。 四、基因转移和基因剔除技术在医学中的应用 建立动物模型 ① 单基因决定疾病模型 基因剔除 获得性突变(gain-of-function mutation) ② 多基因决定疾病模型 放射自显影 未结合探针 结合有蛋白的探针 标记探针 1X 1X 1X 1X 核蛋白提取物 1X 10X 10X 未标记探针 10X 凝胶迁移实验结果示意图 凝胶迁移实验结果图 染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)是目前可以研究体内DNA与蛋白质相互作用的主要方法。 （二）染色质免疫沉淀法 染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图 The establishment and application of heredity-modified animal model 转基因技术 采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。 转基因——被导入的目的基因 转基因动物(transgenic animal) ——目的基因的受体动物 一、转基因技术 二、核转移技术 有目的去除动物体内某种基因的技术, 称为基因剔除（gene knock-out）或基因靶向灭活(gene targeting)。 三、基因剔除技术 模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+ PCR体系基本组成成分 PCR反应循环 变性 95?C左右 延伸 适温 退火 Tm-5?C 经过30个左右的循环后，PCR的扩增倍数为(1+x)n, x=75%, n为循环数. 2. 利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段。 3. 利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得具有一定同源性的基因片段。 4. 利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中随机克隆基因。 1. 与反转录反应相结合，直接从组织和细胞的mRNA获得目的基因片段。 二、PCR技术的主要用途 （一）目的基因的克隆 （二）基因的体外突变 （三）DNA和RNA的微量分析 （四）DNA序列测定 （五）基因突变分析 二、PCR技术的主要用途 RT-PCR技术 AAnA TTnT 5′ 5′ mRNA 反转录酶 mRNA cDNA 3′ TTnT AAnA 核糖核酸酶H TTnT 3′ DNA poly I cDNA 核酸酶S1 双链cDNA 3′ 5′ 3′ 5′ 5′ 加热变性 加入特异性引物 DNA聚合酶 PCR 扩增出大量的产物 实时PCR技术原理 核酸序列分析的基本原理 化学裂解法 (Maxam-Gillbert法)略 DNA链的末端合成终止法 (Sanger法) (Sanger双脱氧链终止法) HO P O P O P O CH2 O O O OH OH OH O A, C, G or T 1′ 3 ′ OH α β γ 5 ′ 双脱氧核苷三磷酸 脱去 二、DNA链末端合成终止法 Sanger 1958年和1980年两次获Nobel奖 The Nobel Prize in Chemistry 1980 for his fundamental studies of the biochemistry of n