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第九章 外源基因在真核细胞中的表达 一、选择标记和报告基因 选择标记之一二氢叶酸还原酶基因 选择标记之一二氢叶酸还原酶基因 选择标记之二胸苷激酶基因 选择标记之三新霉素磷酸转移酶基因 选择标记之四潮霉素磷酸转移酶基因 选择标记之五氯霉素乙酰转移酶基因 选择标记之六抗除草剂基因 选择标记之六抗除草剂基因 报告基因 报告基因之一β-葡糖醛酸糖苷酶基因 报告基因之二氯霉素乙酰基转移酶基因 氯霉素的结构式 氯霉素催化的反应及检测方法 报告基因之三荧光素酶基因 报告基因之四冠瘿碱合成酶基因 冠瘿碱的检测方法 报告基因之五绿色荧光蛋白基因 GFP的性质 绿色荧光蛋白 The Nobel Prize in Chemistry 2008 二、DNA直接导入的基因转化方法 聚乙二醇诱导基因转化 聚乙二醇诱导基因转化 高压电穿孔法 显微注射法 基因枪法 基因枪工作原理图 磷酸钙沉淀法 脂质体载体法 激光微束穿孔法 花粉管通道法 利用载体导入外源DNA 三、农杆菌作载体的植物转基因方法 农杆菌的瘤诱导 农杆菌感染植物形成冠瘿瘤 冠瘿碱 冠瘿碱结构式 Ti 质粒 Ti 质粒的结构 Ti 质粒的结构 Ti 质粒的结构 T-DNA上的基因 T-DNA的边界 Vir区的基因 T-DNA的转移过程 T-DNA的转移过程 农杆菌转基因的载体构建 农杆菌转基因的载体构建 共整合载体pGV3850 共整合载体 共整合载体pGV2260 共整合载体系统的三亲交配 双元载体系统 双元载体系统 小质粒pBin19结构图 三亲交配示意图 农杆菌感染植物细胞的方法 农杆菌作载体的植物转基因方法 农杆菌感染植物细胞的方法 转基因植物的鉴定 四、外源基因转化在基因表达调控研究中的应用 启动子选择 基因构建用于启动子研究 瞬时表达和稳定表达 五、反义RNA及其在基因表达调控中的作用 反义RNA作用的关键部位 反义RNA作用的关键部位 反义RNA对DNA复制的调控 反义RNA对转录的调控 反义RNA对mRNA加工及翻译过程的调控 反义RNA在细胞不同部位的调控作用 导入反义RNA的方法 反义RNA的构建原理 反义RNA技术在肿瘤研究中的应用 反义RNA技术在抗病毒感染中的作用 六、RNA干扰 RNAi 的发现 RNAi 的发现 RNAi 的发现 RNAi 的发现 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006 RNAi 的机理 siRNA RNAi 机理 RNAi 机理 RNAi 机理 RNAi 机理 RNAi 机理 RNAi 机理 RNAi 的技术路线 RNAi发现的意义 由于动物基因的调控序列不被植物细胞识别，细菌基因的调控表达机制与植物十分不同。在研究某种启动子的调控（如缺失和突变研究）时，应以相应的细胞为受体细胞，即该启动子能在这种细胞中启动转录，后接容易检测的报告基因 。 启动子研究 如果以得到转基因的产物为目的，应将目的基因的编码区与能在受体细胞中启动转录的适当启动子相连，在植物受体细胞中可选用花椰菜花叶病毒35S启动子（CaMV 35S启动子）或冠瘿碱合成酶启动子。 瞬时表达（transient expression）： 导入外源基因后在短时间内基因的表达。因其未整合到染色体上，几天后就消失了。此法常用于基因表达调控研究。 稳定表达（stable expression）： 外源基因整合到了染色体上，可稳定地表达并遗传下去。要获得转基因植物或动物，就必须达到稳定表达。 在一个基因中，DNA双链中只有一条链作为模板转录出功能RNA，相对的另一条链为意义链，以意义链为模板转录出的RNA称为反义RNA，它有调控基因表达的作用。反义RNA通过碱基互补与靶RNA（正义RNA）形成双链RNA，从而抑制靶RNA的功能。 1981年首先发现了反义RNA在大肠杆菌ColE1质粒DNA复制中的调节作用。1986年又在真核生物小鼠中发现了反义RNA，以后逐步发现了越来越多的反义RNA。 反义RNA并不需要与正义RNA全长互补，只需要与关键部位互补即可起到抑制作用， ① mRNA 5’端非翻译区：包括SD序列或核糖体结合位点（ribosome binding site，RBS）。SD序列（Shine-Dalgarno sequence）为细菌mRNA起始密码子AUG上游7～12个核苷酸处的一个保守区，这段序列因与16S rRNA 3＇末端反向互补，而被认为在核糖体-mRNA的结合过程中起作用。 ② 起始密码子AUG。 ③ mRNA5＇端帽子形成位点。 ④ 前mRNA外显子与内含子的结合部。 ⑤ mRNA poly A形