第五章分子生物学研究法2.pptVIP

5.3 RNA基本操作技术 5.3.1 总RNA的提取 5.3.2 mRNA的纯化 5.3.3 cDNA的合成 5.3.4 cDNA文库的构建 5.3.5 基因文库的筛选 5.3.1 总RNA的提取 细胞中的总RNA包括： mRNA 1%~5% rRNA 80%~85% tRNA sRNA RNA的抽提方法 1.实验室常用方法：异硫氰酸胍－苯酚抽提法 Trizol试剂：苯酚和异硫氰酸胍组成，可迅速破坏细胞结构，释放细胞质及细胞核中的RNA，并使核糖体蛋白与RNA分子分离，还能保证RNA的完整。 Trizol提取步骤：首先在液氮中研磨材料，匀浆，加入trizol试剂，再加入氯仿抽提，分离水相，异丙醇沉淀。 2. 硅胶膜纯化柱法 将含有目的RNA的细胞破碎液通过该柱，RNA吸附在硅胶膜上，然后在低盐浓度下可从硅胶上直接洗脱RNA。 RNA的浓度和纯度的判断： 可通过测定其OD260和OD280 OD260＝1时，相当于浓度为40μg/mL，当OD260/OD280＝1.8～2.