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  免疫学应用 第二节 免疫学检测 一、抗原或抗体的检测 （一）抗原抗体反应的原理和特点 原理：在适宜条件下，抗原与相应抗体在体外特异性结合后，出现肉眼可见或借助仪器可检测的各种现象，据此对样品中的抗原或抗体能进行定性、定量、定位的检测。 原则：用已知抗体检测未知抗原，也可用已知抗原检测未知抗体。 特点：1.特异性 2.可见性 3.可逆性 1.特异性 一种抗原一般仅能与由它刺激所产生的抗体结合，这种抗原-抗体结合反应的专一性即特异性。 2.可见性 若抗原、抗体的数量比例恰当，抗体分子的两个Fab段分别与两个抗原分子结合，相互交叉连接成网格状复合体，反应体系中基本无游离的抗原或抗体。此时，可形成肉眼可见的明显反应物（沉淀物或凝集物）。 因此，确定抗原、抗体的最适比例十分重要，应根据抗原的物理性状，对抗原或抗体进行稀释，以确定最适比例。 3.可逆性 抗原与抗体的结合为分子表面的非共价结合，结合稳定且可逆。 在一定条件下，抗原抗体结合形成的复合物可被解离，如低pH、高浓度盐、冻融等。 解离后的抗原或抗体分子仍保持原有的理化特性和生物学活性。如解离后的外毒素恢复其毒性，细菌仍可存活。 （二）抗原或抗体检测的类型 根据抗原的性质、结合反应的现象、参与反应的成分因素，可将抗原抗体反应分为： 1.凝集反应 2.沉淀反应 3.免疫标记技术 1.凝集反应 概念：细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后形成凝集团块，此类反应称为凝集反应。 方法：（1）直接凝集反应 （2）间接凝集反应 （3）反向间接凝集反应 （4）间接凝集抑制反应 （5）协同凝集反应 （1）直接凝集反应 将细菌或红细胞与相应抗体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。 玻片法：是用已知抗体与相应抗原在玻片上反应，用于抗原的定性检测，如ABO血型鉴定、细菌鉴定。 试管法：是在试管中连续稀释待检血清，加入已知颗粒性抗原，用于抗体的定量检测，如诊断伤寒病的肥达试验。 （2）间接凝集反应 概念：将可溶性抗原包被在与免疫无关的载体颗粒表面，再与相应抗体反应，出现颗粒物凝集的现象。 常用的载体： 人O型血红细胞 聚苯乙烯乳胶颗粒 间接凝集反应 间接凝集抑制反应 诊断试剂：为抗原致敏的颗粒载体及相应的抗体，用于检测标本中是否存在与致敏抗原相同的抗原。 检测方法：为将标本先与抗体试剂作用，然后再加入致敏的载体，若出现凝集现象，说明标本中不存在相同抗原，抗体试剂未被结合，因此仍与载体上的抗原起作用。如标本中存在相同抗原，则凝集反应被抑制。 2、沉淀反应 概念：血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物，此类反应称为沉淀反应。 方法：沉淀反应多用半固体琼脂凝胶作为介质进行琼脂扩散或免疫扩散。即可溶性抗原与相应抗体在凝胶中扩散，在比例合适处相遇时形成可见的白色沉淀。 （1） 单向琼脂扩散 方法：将一定量已知抗体混于琼脂凝胶中制成琼脂板，在适当位置打孔后将抗原加入孔中扩散。 结果：抗原在扩散过程中与凝胶中的抗体相遇，形成以抗原孔为中心的沉淀环，环的直径与抗原含量呈正相关。取已知量抗原绘制标准曲线，可根据所形成沉淀环的直径，从标准曲线中查出待检标本的抗原含量。 应用：本法常用于定量测定血清IgG、IgM、IgA和C3等。 （2） 双向免疫扩散 将抗原与抗体分别加于琼脂凝胶的小孔中，二者自由向四周扩散，在相遇处形成沉淀线。 若反应体系中含两种以上抗原-抗体系统，则小孔间可出现两条以上沉淀线。 本法常用于抗原或抗体的定性检测、组成和两种抗原的相关性分析。 3.免疫标记技术 概念：是利用荧光素、酶、放射性核素等标记抗体或抗原，进行抗原-抗体反应。 标记物与抗体或抗原连接后并不改变后者的免疫特性。 优点：具有灵敏度高、快速、可定性、定量、定位等优点。是目前应用最为广泛的免疫学检测技术。 （1）免疫荧光法(IF) 概念：用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待检标本中抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原-抗体复合物散发荧光，借此鉴定或定位标本中的抗原。 常用的荧光素：有异硫氰酸荧光素(FITC)和藻红蛋白（PE），前者发黄绿色荧光，后者发红色荧光。 方法：直接荧光法、间接荧光法 免疫荧光法的应用 检查细菌、病毒、螺旋体等抗原或抗体，用于诊断传染病。 鉴定免疫细胞表面的CD分子。 检测自身免疫病的抗核抗体。 （2）酶免疫测定(EIA) 方法：将抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后的显色反应判定结果。其颜色深浅与标记物中相应的抗体或抗原的含量呈正比，由此可测定抗原或抗体的含量。 结果观察：可用目测定性，也可用酶标测定