第八章基因工程菌修改20111.pptVIP

第八章 基因工程菌的发酵 近年来，重组DNA技术(基因工程)已开始由实验室走向工业生产，走向实用。它不仅为我们提供了一种极为有效的菌种改良技术和手段，也为攻克医学上的疑难杂症——癌、遗传病及艾滋病的深入研究和最后的治愈提供了可能；为农业的第三次革命提供了基础；为深入探索生命的奥秘提供了有力的手段。 现在由工程菌产生的珍稀药物，如胰岛素、干扰素、人生长激素、乙肝表面抗原等等都已先后面市，基因工程不仅保证了这些药物的来源，而且可使成本大大下降。但是从许多研究中发现，工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，因而工程菌不稳定性的解决已日益受到重视并成为基因工程这一高技术成就转化为生产力的关键之一。 工程菌的来源和应用 基因工程（genetic engineering）是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，根据人们的意愿，主要是在体外进行基因切割、拼接和重新组合，再转入生物体内，产生出人们所期望的产物，或创造出具有新的遗传特征的生物类型，并能使之稳定地遗传给后代。 二、工程菌的获得 1，确定目的产物。 2，找出产该产物的细胞。 3，将细胞破碎后提纯出全部信使RNA。这些信使中包含了该细胞内表达的所有蛋白质的合成信息。 4，利用基因扩增技术（PCR），找出所需的目的基因。 5，将目的基因连接到设计好的质粒载体，形成了重组DNA分子。 6，将重组后DNA分子引入到受体细胞内，然后选择合适的培养条件使细胞繁殖。根据选择性标记，从菌落中筛选出目的基因的重组(工程)菌。 三、工程菌应具备的条件 1，发酵产品是高浓度、高转化率和高产率的，同时是分泌型菌株。 2，菌株能利用常用的碳源，并可进行连续发酵。 3，菌株不是致病株，也不产内毒素。 4，代谢控制容易进行。 5，能进行适当的DNA重组，并且稳定，重组的DNA不易脱落。 四、工程菌的应用 1，基因药物 例如，红细胞生成素、胰岛素、干扰素、乙肝疫苗、生长激素和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子等。 2，其它发酵产品 例如酶制剂、氨基酸（苏氨酸、色氨酸）、抗生素等。 就生产流程而言，从发酵到分离、纯化目标产物，工程菌和常规微生物并无太多的差异。但工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，以及安全性等问题，使得工程菌的培养有着自身所特有的特点。 第一节 基因工程菌的稳定性 一、基因工程菌的稳定性 基因工程菌的遗传不稳定性（重组质粒、染色体、表达产物），主要表现在重组质粒的不稳定性。 质粒的不稳定可分为 ①质粒复制的不稳定； ②质粒分配不稳定； ③质粒结构的不稳定。 质粒复制不稳定性plasmid replication instability  指基因工程菌复制时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象。 小质粒都是以滚环形式进行复制的，要经过单链DNA中间体阶段。在复制过程中，不正常的起始和终止、延伸时的断裂及错配等都会造成质粒的不稳定，并产生单链质粒和高相对分子质量畸型质粒。 质粒分配不稳定（Plasmid segregation instability) 细胞分裂时，质粒也要分配到子代细胞，但由于在子代细胞中不均一而导致部分细胞完全丢失质粒，结果产生无质粒的细胞。 par基因在细胞分裂时，主动把质粒分配到子代细胞中。没有par基因，质粒在子代细胞中随机分配，从而导致分配不稳定性。分配不稳定性常经过多个世代的传质之后才明显表现出来。 质粒结构的不稳定(plasmid structural instability) 由于质粒中DNA的缺失(deletion)、插入(insertion)、突变(mutation)、重排(rearrangement)等使质粒DNA的序列结构发生了变化，引起复制和表达的不稳定性，工程菌性能改变，这就是质粒结构不稳定性。 一般地，小质粒比大质粒结构稳定性好。基因工程菌的稳定性至少要维持在25代以上。 二、影响质粒稳定性的因素 1．培养基的组成对质粒稳定性的影响 质粒的稳定性与培养基的组成有关，复合培养基营养较丰富，质粒稳定性一般高于合成培养基。 在不同培养基中，还存在质粒丢失概率的差异，不同培养基，基因工程菌的比生长速率也不同。 2．发酵操作方式对质粒稳定性的影响 流加操作方式能保持质粒的稳定性。适宜的流加方式有利于提高质粒在非选择性培养基中的稳定性。 基因工程细胞在对数生长期减少，因为在底物充足时，无质粒的宿主细胞生长较有质粒的工程细胞快，但在静止期又增加，因为在底物耗尽时，宿主细胞死亡也较快。 连续培养而且在无选择压力时，质粒稳定性随稀释速率的增加而下降，但不会完全丢失，如果再加入选择剂，又可提高质粒的稳定性。 两段连续培养可克服质粒不