细胞培养5：培养物的观察和检测方法.pptVIP

培养物的观察检测方法 4.免疫细胞化学技术 4.1 常用免疫细胞化学技术原理 4.1.4 葡萄球菌蛋白A法（staphylococal protein A, SPA法） SPA具有与人、小鼠、猪以及猴等动物的抗体Fc段结合的能力。因此，利用HRP、荧光素或胶体金标记的SPA可以完成标记二抗的功能，堪称“广谱二抗”。 SPA的分子量小，穿透细胞的能力强于抗体，这样可提高方法的敏感度。 培养物的观察检测方法 4.免疫细胞化学技术 4.2 常用的显色标记物 4.2.1 辣根过氧化物酶 4.2.2 碱性磷酸酶 用辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）及其它酶（如碱性磷酸酶）作标记物的ICC常称为免疫酶方法。HRP经细胞化学反应后于标记部位形成稳定的有色终产物。 用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）代替HRP作标记物进行免疫酶染色，主要用于内源性过氧化物酶含量高的细胞，以避免非特异性染色。 培养物的观察检测方法 4.免疫细胞化学技术 4.2 常用的显色标记物 4.2.3 荧光素 用荧光素（(luorescein)作标记物的ICC常称为免疫荧光技术。异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC)和四甲基异硫氰酸罗达明( tetramethylrhodamine isothiocyanate, TMRITC）是最常用的荧光素。 用荧光素作标记物无需呈色反应，因而省时简便。但由于荧光会逐渐减退，故染色后应尽早观察和摄影。 近年启用的抗褪色剂DABCO[1-4diaza-bicyclo(2-2-2) octane］封固能有效延长染色后标本的可观察期至一周或更长。如封固后盖玻片四周用指甲油（非丙酮溶剂）密封，效果则更好。封固后的标本不观察时均应置于避光、4℃或低温处。 培养物的观察检测方法 4.免疫细胞化学技术 4.2 常用的显色标记物 4.2.4 胶体金与免疫金银技术 胶体金(colloid gold)即金的水溶液，为最常用的金属标记物。用胶体金作标记物的ICC称免疫金技术。 免疫金技术和免疫荧光技术一样，免疫染色后即可于镜下观察，无需标记物的显示程序。 供光镜观察的免疫金染色使用的胶体金颗粒直径通常较大，为20nm，镜下呈粉红色。体积大的金颗粒与抗体的结合不十分稳定，这便降低了免疫金方法的敏感度。 培养物的观察检测方法 4.免疫细胞化学技术 4.2 常用的显色标记物 4.2.4 胶体金与免疫金银技术 尔后发明的免疫金银技术则有效地避免了这一缺陷。 其原理是：使已在抗原位置沉积的金颗粒发挥催化作用，促进银离子被氢醌（hydroquinone）还原为银原子，后者围绕金颗粒形成一层银壳；银壳本身也具有催化作用，使更多的银离子还原沉积，银壳便增大，镜下呈黑色颗粒。这样抗原的存在部位便显著放大。因而免疫金银技术可以使用与抗体结合牢固的5～10 nm胶体金。 据认为，免疫金银技术敏感度高于PAP法。 4.3 免疫细胞化学方法及标记物的选择 培养物的观察检测方法 4.免疫细胞化学技术 理想的方法应是敏感、简便、快速以及经济，但主要取决于所研究的标本及其抗原的分布与含量。 一般来讲，估计抗原含量中等以上的标本可应用间接法或SPA法。如果有荧光显微镜则可采用便捷的免疫荧光技术。估计抗原含量中等以下宜采用LSAB法、PAP法或者免疫金银技术。 4.3 免疫细胞化学方法及标记物的选择 培养物的观察检测方法 4.免疫细胞化学技术 ICC与免疫组织化学（immunohistochemistry）的不同之处在于后者要做组织切片，细胞被切开后，核与胞质内的抗原暴露于抗体，二者极易结合。而ICC技术的染色对象一般为完整的细胞。 细胞膜在固定后其通透性虽有所增强，但对于抗体这样的大分子仍嫌不够，需进一步提高。常用方法为以去垢剂Triton X脱去细胞膜中最主要的成分脂质。另一方面是要选择分子量较小因而穿透性较大的探针。 用小分子量的荧光素或生物素标记的二抗均比酶标者穿透性大，用SPA代替二抗也是一种明智的选择。而用PAP与胶体金一般较适用于细胞表面抗原的染色。 培养物的观察检测方法 4.免疫细胞化学技术 4.4 免疫细胞化学的一般问题 4.5 免疫细胞化学染色的典型程序 （略） （略） 培养物的观察检测方法 5.原位杂交技术 免疫细胞化学是在翻译水平检测基因的表达结果（蛋白质），原位杂交（in situ hybridization, ISH)技术则是检测基因的有无及在转录水平检测基因的活性(mRNA)。 ISH的原理是：应用带有标记物的已知碱基顺序的核酸探针与细胞内待测的核酸（DNA或RNA）按碱基配对的原则进行特异性原位结合