第四章目的基因的获得race.pptVIP

RACE（ Rapid Amplification of cDNA Ends） 技术 5’-RACE 3’- RACE RACE 技术的发展 经典的RACE技术是由Frohman等（1988）发明的，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA 5’和3’ 端，从而获得mRNA（cDNA）完整序列的方法又称锚定 PCR (anchored PCR)和单边PCR (one-side PCR)。 RACE 技术的发展 该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点。也因此取得了更先进的RACE技术。 目前己商业化的RACE技术产品推出，如常用的CLONTECH的SMARTTM RACE技术术。 SMART (Switching Mechanism At 5‘ end of RNA Transcript) 。 主要是引物设计及RT-PCR技术的改进 改进之一：利用锁定引物（lock docking primer）合成第一链cDNA， 改进之二：在5 端加尾时，采用poly(C)，而不是poly(A)； 改进之三：采用RNase H-莫洛尼氏鼠白血病毒（MMLV）反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温（60℃~70℃）有效地逆转录mRNA，从而消除了5 端由于高CC含量导致的mRNA 二级结构对逆转录的影响； 改进之四：采用热启动PCR （hot start PCR）技术和降落PCR（touch down PCR）提高PCR反应的特异性。 2. 利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5‘末端时自动加上3-5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo (dG)通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头。 3. 然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM作为上游引物，用一个基因特异引物GSP2作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5‘末端的cDNA片段扩增出来 利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核苷酸序列通用接头引物的Oligo(dT) 30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。 然后用一个基因特异引物GSP1作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3‘末端的DNA片段扩增出来。 随着RACE的不断改进和完善，优化条件下PCR扩增效率和忠实性的提高及PCR产物克隆技术的迅速发展，RACE已经在基因克隆及基因表达研究中发挥越来越大的作用。 3、序列在其他物种上也未见报道： 采取其他方式获取目的基因，如文库构建等 第五节 从基因文库、cDNA文库获取目的基因 2. 构建基因文库的载体选用 3. 基因文库构建的一般步骤 （2）载体与基因组DNA大片段的连接 （3）重组DNA转化受体细胞 根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞 　　常见的宿主细胞： DH5?：用于铺制与培养质粒平板和粘粒平板的重组缺陷 　　　型的抑制型菌株，可与pUC编码的?-半乳糖苷酶氨 　　　基端实现?互补。 HB101：用于大规模制备质粒的抑制型菌株，转化效率高 JM101：可支持带有琥珀突变载体生长的宿主菌 JM109：支持带有琥珀突变载体生长的重组缺陷的抑制型菌 MZ-1：温度敏感的溶源性菌株，用于含有噬菌体ＰＬ启动子 　　　质粒载体的宿主菌 重组质粒转化受体细胞 1）转化法(transformation) 2）转导法(transduction) 通过病毒把无毒性DNA转移至一个细胞中 3）转染法(transfection) 把DNA转移至动物细胞中的过程 （4）基因组文库克隆子的保存与筛选 基因文库的保存 影印膜滤保存法 文库在液体培养基中扩增保存 方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养基中，混合的细菌生长数代后，其培养物于-70 oC储存（加终浓度为25%的甘油）。 缺点：因文库菌落生长的不均匀性而导致文库中某些特定的序列过多或过少。 保存单个克隆子于含有甘油的培养基中 方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合适的含抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入终浓度为25%的甘油，于-70 oC或-25 oC下保存。 缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大 4. 基因组文库的大小 二、 cDNA文库的构建 4. 构建cDNA文库的一般步骤 （2）mRNA的分离纯化 ② 降解mRNA模板 ③ cDNA第二链合成 去掉发卡结构 b. 置换合成法： 原 理： 以第一链合成产物cDNA:mRNA杂交体作为模