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诺赛基因腺病毒服务 2011年7月26日 Outline 腺病毒 腺病毒载体 腺病毒载体的应用 Adxsi重组腺病毒载体系统 腺病毒载体的质检 如何使用和操作病毒 腺病毒 结构组成 分类 基因组 感染细胞机制 腺病毒细胞转化作用 腺病毒的结构组成 分类 5型腺病毒的基因组结构示意图 腺病毒基因组重要组件 腺病毒的感染细胞过程 先结合CAR，再结合整合素 内吞作用将腺病毒内化到细胞中并进入溶酶体 从溶酶体中释放 腺病毒颗粒转位到细胞核 通过核孔将病毒DNA释放到细胞核内 转录，复制，病毒包装在细胞核中进行。 腺病毒的细胞转化作用 E1A蛋白与RB105蛋白作用，55kD的E1B基因产物与P53作用，这两种复合物的形成使细胞失去生长控制 19kD的E1B蛋白可能与抑制腺病毒转化细胞的凋亡有关。 293细胞为Ad5 DNA片段转化的细胞，其基因组含有腺病毒DNA左端的11％。 腺病毒载体 腺病毒作为载体的优点 与其他病毒载体比较 腺病毒载体的改造 腺病毒作为载体的优点 广泛的细胞感染范围 不整合基因组 非致病的病毒 能得到较高的病毒滴度 容易构建，容易改造 不随生殖种系遗传 与其他病毒载体比较 腺病毒载体的改造 腺病毒载体的其他改造 第二代腺病毒（去掉了E2或E4） 第三代腺病毒（几乎去掉了腺病毒所有基因） Ad5-F35 （5型fiber换成35型fiber） Ad5-F3 （5型fiber换成3型fiber） 溶瘤型腺病毒（保留了E1区部分基因） 条件复制型腺病毒（由条件启动子启动E1） 腺病毒载体的应用 腺病毒载体应用的领域 腺病毒载体应用过程中的瓶颈 腺病毒载体的应用领域 基因转染 蛋白表达 基因治疗 腺病毒疫苗 细胞移植 iPS 腺病毒载体应用的瓶颈 病毒靶向性问题 病毒的免疫原性为题 Targeting Ad-vetors Genetic modification of viral coat proteins Tumor-specific promoters Conjugation with targeting ligands or polymers Eluding AdenoviralVector Immunity Immunosuppression Immunomodulation serotype switching Use of targeted Ad vectors microencapsulation of Ad vectors use of helper-dependent (HD) Ad vectors development of nonhuman Ad vectors Adxsi载体系统 腺病毒载体构建流程 Adxsi载体系统特点 与其他载体系统的比较 常用穿梭载体介绍 重组腺病毒的构建流程 病毒载体构建 病毒包装，小量扩增 病毒大量扩增及纯化 滴度测定 Adxsi载体特点 Ad5型E1、E3缺陷的腺病毒 直接连接的方案（I-Ceu I,I-Sce I双酶切） 重组克隆阳性率高 能包装对细胞有毒性的基因或者对病毒包装复制扩增等有干扰作用的基因 病毒滴度高 与其他载体系统比较 体外直接连接（Clontech公司 Adeno-X系统） 细菌内同源重组（Adeasy系统） 293细胞里面同源重组（本元正阳Admax系统） 体外同源重组（invitrogen公司，ViralPower系统） 常用穿梭载体介绍 各种报告基因的载体 各种标签的载体 诱导表达穿梭载体系统 iPS相关载体系统 腺病毒载体的质检 穿梭载体的质量检测 -----酶切、测序、PCR 病毒载体的质量检测 -----酶切、测序、PCR 病毒包装过程检测 -----镜下观察、CPE 病毒的质量检测 -----滴度测定、PCR、RCA及纯度检测 CPE早期 CPE晚期 滴度测定方法介绍 OD260法 空斑形成法 TCID50法 VP,PFU,IU VP：病毒颗粒（viral particle），包括“活”病毒和“死”病毒，用OD260法测定 PFU：空斑形成单位（plaque formation unit），梯度稀释法测定 IU：感染单位（infectious unit）， TCID50法测定。 OD260法 (OD260) x (viral dilution) x (cuvette dilution) x 1.1 x 1012 =_______OPU/mL 只适合测定纯化的腺病毒 TCID50法 T =10 1 + d ( S - 0.5 ) d = Log 10 of the dilution (= 1 for a ten-fold dilu