mir-150与转录因子c-myb靶向结合控制b细胞的分化.pptVIP

LoxP序列：来源于P1噬菌体，是有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。其序列如下： 　　 5 - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3 　　 3 - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5 值得注意的是，miR-150的异位表达在我们的转基因小鼠的非造血细胞系似乎不会有任何明显的不良生理效应，尽管ROSA26基因座上的启动子CAG驱动其在老鼠的大部分组织中的表达。因此，miRNA介导的控制，也可以显示特异性地将功能限制到一个特定的分化途径。最后，我们的研究证实，在体内环境下，miRNA与它的结合位点之间有1-8个核苷酸的完美匹配， 该位点为进化保守位点，以及位点的数量是很好的功能指标，是以之前提出了靶基因预测。 该报告分析的结果即为通过c-Myb mRNA的3UTR端的两个保守的miR-150结合位点实现miR-150直接调节c-Myb蛋白水平。 MiR-150的基因剔除小鼠的表型，与在正常生理下c-Myb是miR-150的主要目标这一概念是兼容的。这里的miRNA主要在成熟淋巴细胞表达。根据其遗传消融，B1细胞，在脾脏和腹腔中增加，其表型与B细胞特异性c-Myb删除时看到的B1细胞消融的表型相反。 六、结论 * * Mir-150与转录因子c-Myb靶向结合控制B细胞的分化 2110424 何晓丹 MiR-150是一种在成熟淋巴细胞中特异性表达的microRNA (miRNA)，但并不在其祖细胞中表达。MiR-150在体内与c-Myb靶向结合，影响淋巴细胞的发育和免疫响应。c-Myb是一种控制淋巴细胞发育多个步骤的转录控制因子。 B细胞在老鼠和人体的发育和分化是复杂的过程，它从胎肝和具有增殖能力的祖细胞的骨髓开始，它们的抗原受体基因经历有序重排产生分化。 B细胞成熟四阶段 祖B细胞（pro B cells） 前B细胞（pre B cells） 未成熟B细胞（immature B cells） 成熟B细胞（mature B cells） 一、淋巴细胞发育过程中miR-150的阶段特异性表达 为了研究miRNAs在淋巴细胞发育中的生物学功能，我们研究了miRNAs在淋巴细胞发育特定阶段行为中的特异性表达，通过将基因表达谱和Northern blot分析相结合，我们确定了符合这个标准的一些miRNA。 MiR-150，一种在成熟和休眠的淋巴细胞中高度表达的miRNA，但不是在它们的祖细胞中。这种阶段特异性表达模式表明了miR-150可能在淋巴细胞发育或功能中发挥作用。 二、MiR-150靶向结合转录因子c-Myb C-myb基因，淋巴细胞正常发育的一个重要的转录因子，是miR-150的首要靶向结合目标基因之一。 C-Myb在淋巴细胞发育中的表达模式是与miR-150相辅相成的，因为c-Myb在淋巴祖细胞中高度表达，在成熟细胞中下调。 三、 miR-150的缺乏导致B1细胞增殖和增强体液免疫应答 B细胞特异性缺失C-Myb基因将严重阻碍B细胞从祖B细胞（pro B cells）向前B细胞（pre B cells）转换以及其中一个成熟B细胞亚基的缺失，即所谓的B1细胞。如果miR-150在体内的确是与c-Myb靶向结合，预测miR-150的不足将导致的表型与由于c-Myb的丢失所引起的表型相反，以及miR-150在祖B细胞的异位表达将阻碍B细胞发育。 Cre-Loxp重组酶系统在新型基因打靶中获得广泛应用，是条件性基因打靶、诱导性基因打靶、时空特异性基因打靶策略的技术核心。 Cre重组酶：Cre 重组酶是一种由 343 个氨基酸组成的单体蛋白，它不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能介导两个LoxP位点（序列）之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。 酶联免疫法（ELISA法） ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA）基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。 （一）双抗体夹心法 （二）间接法 （三）竞争法 （四）双位点一步法 （五）捕获法测IgM抗体 （六）应用亲和素和生物素的ELISA 捕获法测IgM抗体