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第六章 微生物的生长繁殖与生存因 6.1微生物的生长繁殖 一、微生物生长繁殖的概念 生长：微生物生长是代谢的结果，当同化超过异化作用，细胞物质量增加，个体重量和体积增大，就是生长。 繁殖：个体数量的增多。 发育：微生物的生长与繁殖是交替进行的。从生长到繁殖这个由量变到质变的过程叫发育。 世代时间（G）：细菌两次细胞分裂之间的时间。 纯培养：微生物在自然界中不仅分布很广，而且都是混杂地生活在一起。要想研究或利用某一微生物，必须首先把混杂的微生物类群分离开来，以得到只含一种微生物的纯培养。 微生物学中将在实验室条件下得到1个细胞繁殖后代的过程。 二、纯培养的分离方法 最常用的分离方法： 稀释法 划线法 及利用选择培养基分离法等。 先将待分离的材料作一系列的稀释(如10－1、10－2、10－3、10－4……)，然后分别取不同稀释度的溶液少许， 涂布和稀释倒平板法 2 平皿划线分离法 用接种环沾取少许待分离的材料，在无菌平板培养基表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物将随着划线次数的增加而分散，经培养形成菌落 划线开始的部分细菌分散度小，形成的菌落往往连在一起；由于连续划线，微生物逐渐减少，划到最后，常可形成单个孤立的菌落，这种单个菌落可能由一个细胞繁殖而来，故可获得纯培养。 3. 单细胞挑取法 这种方法是从待分离的材料中挑取一个细胞来培养，从而获得纯培养。 4. 组织分离法 主要用来分离高等真菌和某些植物病原菌。 5.利用选择培养基分离法 不同微生物需要不同的营养物质 有些微生物生长适于酸性环境，有些则适于碱性环境，各种微生物对不同的化学试剂如消毒剂(酚)、染料(结晶紫)、抗生素及其他物质等具有不同的抵抗能力。 利用这些特性，便可配制成适合于某种微生物生长，而限制其他微生物生长的各种选择性培养基，以达到纯种分离的目的。 三、微生物生长的测定方法 生物生长量的测定：可以根据菌体细胞数量、菌体体积或重量作直接测定，也可用某种细胞物质的含量或某个代谢活性的强度作间接测定。 （一）细胞数量的测定 1.直接计数法（又称全数法） （1）血球计数板法 本法仅适用于单细胞的微生物类群。测定时需用细菌计数器(petroff-Hausser counter）或血球计数板(适用于酵母、真菌孢子等)。 血球计数板中央有一个容积一定的计数室( 0.1 mm3)。将经过适当稀释的菌悬液或孢子液放在血球计数板与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数，然后将所观察到的微生物的数目换算成单位体积内的微生物总数。 但应注意，用于直接测数的菌悬液浓度一般不宜过低或过高(常大于106个/ml）；活跃运动的细菌应先用甲醛杀死或适度加热停止其运动。 血球计数板 （2）涂片计数法 将已知体积（0.01 ml)的待测样品，均匀地涂布在载玻片的已知面积内（1cm2),经固定染色后，在显微镜下选择若干个视野计算细胞的数量。视野可用镜台测微尺测得直径并计算其面积，从而推算1cm2总面积中所含细胞数目。 本法的优点是快捷简便、容易操作，缺点是难于区分死活细胞及形状与微生物类似的杂质。 （3）比浊法 这是测定悬液中细胞数的快速方法。 其原理是根据在一定的浓度范围内，菌悬液的微生物细胞浓度与液体的光密度（混浊度或OD值）成正比，与透光度成反比。菌数越多，透光量越低。 可使用分光光度计测定菌悬液的光密度或透光率反映细胞的浓度。然后将未知细胞数的悬液与已知细胞数的悬液相比，可以从已知悬液的稀释倍数，求出未知悬液所含的细胞数。 （二）间接计数法（又叫活菌计数法） 1.稀释平板计数法 像稀释倒平皿分离法一样，先将待测菌液作一系列10倍稀释，使平皿上长出的菌落数在30～300个之间。 然后将最后三个稀释度个各取一定量（0.2ml）与融化并冷却至45℃左右的琼脂培养基一起，倾入无菌平皿中摇匀，静置，待凝固或进行保温培养，通过平皿上出现的菌落数，便可推算出原菌液含菌数。 计算公式： 总活菌数/ml＝同一稀释度三次重复的菌落平均数×稀释倍数×5 将待测样品作一系列稀释，一直稀释到该稀释液的少量（如1毫升）接种到新鲜培养基中没有或极少出现生长繁殖。 根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度（即临界级数），再用“或然率”理论，可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值。 具体的说，菌液经多次稀释后，一定量菌 液中可以极少甚至无菌，然后将待测菌液于液体培养基中。 样品按十倍稀释度作一系列稀释，每个稀释度取3～5次重复，培养后，将有细菌生长的最后三个稀释度中出现细菌生长的管数作为数量指标，由统计分配表上查出近似值，再乘以数量指标第一位数的稀释倍数，即为原菌液中的含菌数。 此方法只有因某种原因不能使用琼脂平面菌落数计数时才使用。如牛奶等。 例1--某一细菌