第二讲免疫器官的观察与免疫细胞的分离.pptVIP

参考书籍及网站 * 胸腺哺乳动物的中枢免疫器官，是T细胞分化、发育的场所，其髓质中含成熟的T细胞和巨噬细胞，皮质中富含不成熟T细胞，在胸腺微环境中，未成熟T细胞经历复杂的选择过程而发育为成熟的T细胞 胸腺的结构 表面有结缔组织被膜，结缔组织伸入胸腺实质把胸腺分成许多不完全分隔的小叶。小叶周边为皮质，深部为髓质。 淋巴结表面有薄层被膜，数条输入淋巴管（afferent lymphatic vessel）穿过被膜通入被膜下淋巴窦。被膜结缔组织伸入实质形成小梁（trabecula）。淋巴结的一侧凹陷称为门部（hilus）此处有较疏松的结缔组织伸入淋巴结内，血管、神经和输出淋巴管（efferent lymphatic vessel）由此进出淋巴结（图9－10）。从门部分支形成的小梁与从被膜伸入的小梁相互连接，构成淋巴结的粗支架，在此粗的网状支架之间充填着网状组织，构成淋巴结的微细支架。淋巴结分为皮质和髓质两部分 * 分离单核细胞所用方法是Percoll非连续性密度梯度离心法，主要是根据不同细胞间密度的差别进行细胞分离。此法易操作，且使用通常的实验设备即可完成。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。 离心后管内分为三层，上层为血浆和Hanks液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带(如下图)，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。 样品分选原理：流式细胞计的分选功能是由细胞分选器来完成的。总的过程是：由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴，根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中；其它液体被当作废液抽吸掉， 工作原理 临床实验室 将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。 流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。 这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，液可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。 临床实验室 检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据，既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。 细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。 临床实验室 文章来自临床实验室仪器信息网(www.Clin-Lab.Com) - 详文链接：/html/xueye/liushi/liushiXx/200903/12-5684.html 根据表面是否表达CD4或CD8分子，可将人成熟T细胞分为CD3+CD4+CD8-和CD3+CD4 CD8+T细胞，简称CD4+T细胞和CD8+T细胞。CD8+T细胞识别由MHC I类分子呈递的由8～11个氨基酸组成的短肽，发挥杀伤、细胞因子分泌等效应功能。 MHC-肽多聚体技术检测的原理 主要组织相容性抗原(MHC)是位于细胞表面的糖蛋白，具有高度多态性，在免疫应答中起着呈递抗原的作用。来源于内源性蛋白的抗原肽与MHCI类分子结合可特异性地被抗原特异性CD8 T细胞结合。MHC I类分子是由具有高度