RTPCR(realtimepcr)在检测细胞的凋亡中与其他方法相比有何优缺点.docVIP

RT-PCR（real－timepcr）在检测细胞的凋亡中与其他方法相比有何优缺点 RT-PCR（real－timepcr）在检测细胞的凋亡中与其他方法相比有何优缺点 病情描述：做视网膜中bcl-2和bax两个因子用TR-PCR和其它的方法比如免疫组化相比有何优缺点，多说一点优点。 专家意见： RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。使用天为时代公司的总RNA提取系统（如目录号DP405和DP406），所获得的RNA的纯度高，基因组DNA污染少，用于RT-PCR系统可得到满意结果。用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、OligodT及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。请看以下资料首先，本试验中采用荧光定量RTPCR测定caspase3(CPP32)mRNA的表达，结果发现，在MCAO后8h，CPP32mRNA表达明显升高，峰值出现在24h，3d后恢复正常，由于CPP32mRNA表达的调节与核内非激活状态的caspase3含量有关，故可以认为CPP32mRNA表达升高是由于核内caspase3大量激活及消耗的原因，补充的大量caspase3是凋亡加重的原因之一。caspase2主要在激活caspase3的过程中起中介作用，本实验对脑梗死后半影区内caspase2mRNA表达水平测定发现无论是脑梗死或预防性FNs脑保护治疗,均对其影响不大,可能与其对缺血/缺氧性损害的反应较迟钝有关。IAP（theinhibitorofapoptosisprotien）是一个蛋白家族，存在于从昆虫到人类的所有动物种群中，包括nIAP、xIAP及rIAP等，其中rIAP（theratinhibitorofapoptosisprotein1）是大鼠所特有的，IAP可抑制caspase3、7等凋亡执行因子的活性而抑制凋亡，故其含量的高低与机体对凋亡的抵抗力有关，本实验发现在脑梗死后，梗死半影区脑组织rIAPmRNA表达在梗死12h后明显升高，有报道提示在有效预防性脑保护治疗如持续性小脑电刺激等，可使MCAO后8hrIAPmRNA表达升高约100%，并持续到MCAO术后12h，该结果提示可提高脑组织对凋亡的抵抗力的因素，可通过减轻半影区神经元凋亡，达到神经保护、同时改善预后的作用。综上所述，在SHR脑梗死后，病灶半影区凋亡细胞明显增多，与促凋亡抑制蛋白rIAPmRNA的表达升高及caspase3激活的加快有关。本组实验通过形态学、分子生物学及图像分析等方法，探讨了缺血性损伤与神经元凋亡的关系，结果发现，在缺血性脑损害中，病灶半影区凋亡细胞计数明显升高，出现梯形DNA电泳带(DNALaddering)及与凋亡相关的蛋白质在梗死发生后8～24h大量合成，提示神经凋亡是脑缺血损害机制的一部分。缺血性神经元凋亡是一个复杂的过程，既往在动物实验中已发现，由于线粒体的能量耗竭，包膜破坏，大量活性物质外溢，包括NO分子、bcl2分子等，激活胞浆中caspase8和caspase9，二者再进入核膜，激活核内的caspase3，被激活的caspase3除可触动一系列瀑布式的效应外，还可自我激活更多的caspase3，从而产生放大效应，并最终作用于核内的大量底物蛋白，如具有DNA修复功能的PARK蛋白，细胞周期调节因子，DNA结构蛋白，及Bcl2家族成份，使这些蛋白失活，DNA因修复不能而裂解，一般而言，当caspase3被激活后则预示着细胞已不可避免的走向程序化死亡，尽管此时细胞的外形和成份并无明显的改变，所以caspase3是凋亡发生的中心环节，它既是启动者，又是执行者。caspase3的激活包括一系列水解反应，最终暴露出活性部位(C18基因)，M30受体可特异性与该基因结合，所以能在DNA修复障碍出现之前就发现凋亡的改变，本试验结果发现，在脑梗死后3h，凋亡细胞数即开始升高，8～24h达高峰，3d后开始下降，该结果与既往报道基本一致。参考资料： 女性脲原体DNA-PCR（UU-DNA)检查结果 我老婆的检查结果如下,请分析下,谢谢:两项检查:???????脲原体DNA-PCR（UU-DNA）6.0X10^5。?参考值是〈25 ???????左宫旁见一囊性包块，大小41X19mm，边界清，内可见细小光点，外周可见卵巢组织回声．不能确定，囊性包块