siRNA的合成方法.docxVIP

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA(double strandedRNA， dsRNA)分子在mRNA水平关闭相应序列基因表达或使其沉默的过程。dsRNA可以抑制不同类型细胞的靶向基因表达，用特异性的抗体几乎检测不到靶向基因所表达的蛋白质。因此，RNAi技术又被形象地称为基因敲除(knock out)或基因沉默(gene silencing)。1 RNAi技术的发展过程早在1990年，植物学家Jorgeen等人用矮牵牛花做试验，探生网将紫色素合成基因导入植物体，尝试将更多拷贝的色素基因注入植物体，使花朵的色 彩更加艳丽。结果许多花朵没有开出更艳丽的花朵，反而开出白色的花朵。进一步分析发现，这些转入的基因不但自身没有表达为蛋白质，反而关闭了牵牛花中与其 同源的色素相关基因的表达。由于这种由外源基因的导入而造成的抑制作用最初被确认是发生在转录后水平，称这种现象为共抑制(cosureion)[2]。1994年，Cogoni等人将外源性类胡萝卜素基因导入野生型粗糙链孢霉菌，结果转化细胞中内源性的类胡萝卜素基因也受到了抑制，他们称这种基因失活形式为消除作用或基因压制(quelling)[3]。1995年康乃尔大学的Guo[4]博 士在实验中想通过反义RNA阻断美丽线虫(C. elega)的par-1基因表达，同时还用正义RNA做了一个对照，试图观察到对照试验组基因表达增强的现象，但结果却发现了反义和正义RNA都阻断了 该基因的表达，Guo等人一直不能解释该现象。直到1998年Fire等[5]才发现这是由于Guo博士在试验中污染了双链RNA而引起的。他们还证明转录得到的单链RNA经纯化后注射线虫所引起的阻断作用十分微弱，而经纯化的双链RNA则能高效特异地阻断相应基因的表达，他们将此现象称为RNA干扰。1999年， Hunter[6]等 的实验进一步验证了RNAi的存在。他们将dsRNA去除后，再将正义或反义的RNA注入线虫卵中，没有产生基因沉默现象。相反，如果将上述正义及反义 RNA混合，经退火复性后得到的dsRNA注入线虫卵中可以显著地产生基因沉默现象，从而印证了Fire等提出的RNAi作用是由dsRNA引起的结论。 2000年首次在果蝇中发现，通过核糖核酸酶可将长的dsRNA处理为21～23 nt的短片段。2001年，首次报道了哺乳动物细胞中也有RNAi。2002年证明了用短的发夹结构RNA（shRNA）在哺乳动物细胞中可以诱导特异性的基因沉默[7]。2003年首次用RNAi技术对模型动物进行了治疗研究[8]。 2006年诺贝尔医学奖没有坚持研究成果要经过数十年实践验证的“惯例”，破格授予美国科学家安德鲁?菲尔和克雷格?梅洛，以表彰他们1998年发现了 RNAi现象。此后，人们在不同种属的生物中进行了广泛而深入的研究，结果证实dsRNA介导的RNAi现象存在于真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、涡虫、水 螅、斑马鱼、小鼠、大鼠、猴乃至人类等多种生物中[2]。2 RNAi的作用机制目前关于基因沉默的假说认为，转录后水平的基因沉默，主要包括起始阶段、效应阶段和倍增阶段。2．1 起始阶段外源性导入或由转基因、转座子、病毒感染等多种方式引入双链核糖核酸(dsRNA)， 在细胞内特异性与RNA酶Ⅲ(RNAaseⅢ核酸内切酶) Dicer结合，dsRNA被切割成21~23nt长度的带有3′端单链尾巴及磷酸化的5′端的短链dsRNA，即小干扰RNA(siRNA)。（以下图 片均来自于陈莉等的文章《在医药领域中RNA干扰研究进展》）?2.2 效应阶段双链siRNA可以与含Argonauto（Ago）蛋白的核酶复合物结合形成RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）并被激活。在ATP供能情况下，激活的RISC将siRNA的双链分开，RISC中核心组分核酸内切酶Ago负责催化 siRNA其中一条链去寻找互补的mRNA链，然后对其进行切割。反义链先与同源mRNA配对结合，然后RISC在距离siRNA 3端12个碱基的位置将mRNA切断降解，从而阻止靶基因表达，使基因沉默[9]。?2.3 倍增阶段siRNA在RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP) 的作用下，以mRNA为模板，siRNA为引物，扩增产生足够数量的dsRNA作为底物提供给Dicer酶，产生更多的siRNA， 可再次形成RISC，并继续降解mRNA，从而产生级联放大效应。并作用于靶mRNA。如此反复倍增，从而使RNAi的作用进一步放大。因此少量的 siRNA就可以产生高效的基因沉默效果[10]。3 RNAi的设计及合成3.1 siRNA的设计设计高效率的siRNA首先要通过NCBI、DDBJ、BMBL这3个基因序列数据库，检