实训二唾液淀粉酶的最适PH测定学生版.docxVIP

PAGE \* MERGEFORMAT4 实训二 唾液淀粉酶的最适PH测定 实验目的 1、了解pH对酶活力的影响 2、了解什么叫最适pH，掌握测量pH对酶活力影响的基本原理和方法 实验原理 影响酶反应活力的因素很多，影响胞外酶的因素主要包括PH值、温度和金属离子、抑制剂及其他小分子，以及酶浓度等因素。 PH值对酶反应活力的影响： 1、 酸或碱可以使酶的空间结构破坏，引起酶的活力丧失，这种丧失活力可以是可逆的或者是不可逆的，对可逆的来说，改变PH值后可使活力恢复。 2、 酸或碱影响酶的活性部位催化基团的离解状态，使得底物不能分解成产物。 3、 酸或碱影响酶的活性部位结合基团的离解状态，使得底物不能和它结合。 4、 酸或碱影响底物的离解状态，或使底物不能和酶结合。 由于上述种种原因，各种酶的作用都有一个最适合的PH值范围。 最适pH 酶的催化活性与pH环境有密切关系，通常各种酶只在一定pH范围内才具有活性，酶活力最高时的pH，称为酶的最适pH。高于或低于此pH时酶的活性逐渐降低。 用酶活力对PH值作图，往往是钟罩形曲线。最适合的PH值还随着底物浓度、温度和其他条件的变化而变化，因此确定最适合的PH值应在所实验的条件下测得。 需要注意的是： 酶的最适pH不是一个特征性常数。不同种类的酶其最适合的PH值范围不同； 同一种酶，来源不同，其最适合的PH值也有差异； 同一种酶由于作用底物不同，酶最适合的PH值也不同； 同一种酶作用于同一底物，随着温度等条件变化，最适合的PH值也有变化。如唾液淀粉酶最适pH为6.8，但在磷酸缓冲溶液中，其最适pH为6.4—6.6，而在乙酸缓冲溶液中则为5.6。总之，不同的酶在不同的PH值范围不仅稳定性不同，而且活力也不同，在最适合的PH值内活力最强，这是酶的一个重要特征，要仔细控制。 实验器材 电热恒温水浴锅，电炉，电子秤，试管10支，试管架，100mL容量瓶，小烧杯，移液管（1mL，2mL，5mL，10mL），三角瓶7个，胶头滴管，玻璃棒，12凹白瓷板，吸耳球 实验材料 0.3%NaCl的0.5%淀粉溶液100ml（新鲜配制）：称取0.30gNaCl溶于80mL水中，电炉加热煮沸，加入0.50g淀粉溶解至澄清透明，冷却，定容至100mL 0.2mol/L Na2HPO4溶液 200ml 0.1mol/L柠檬酸溶液 100ml 不同浓度的唾液淀粉酶（1：100，1：200，1：400···） 碘化钾一碘溶液（20KI和10g碘溶于100m1水中，使用前稀释10倍） 实验步骤 不同PH缓冲液的配制： 表1：不同PH缓冲液的配制成分表 试剂PH值5.46.06.46.87.27.68.00.2mol/L Na2HPO4溶液/mL11.1512.6313.8530.9017.3918.7319.450.1mol/L柠檬酸溶液/mL8.57.376.159.102.611.270.55总体积/mL20.020.020.040.020.020.020.0将配好的溶液分别置于已标号的三角瓶中待用 唾液的获取： 蒸馏水漱口后在口中含蒸馏水，适宜时间后（约3分钟）将蒸馏水连同唾液一同放置于事先准备好的容器中即可，三层纱布过滤，在实验过程中应注意酶的失活，为了防止此现象发生应将此液体置于冰水中冷却； 3、 确定最佳保温时间： 取3支洁净试管（1-3），分别加入0.3%NaCl的0.5%淀粉溶液2 mL，然后加入PH6.8的 Na2HPO4—柠檬酸缓冲溶液3 mL，分别加入稀释不同倍数的唾液淀粉酶各2 mL，充分摇匀后，放入37℃水浴中保温并计时，每隔1min用滴管取1滴混合液于点滴板上，加1滴碘液，检验淀粉水解程度，为橙黄色时，为水解完全，为进一步确定保温时间，应加1滴碘液至试管中，若为橙黄色时表示反应完全，记录所需保温时间。最佳保温时间应在8—12min左右，若偏差太大，应该加以稀释，因此要掌握好唾液淀粉酶的稀释浓度。 4、测定唾液淀粉酶的最适PH： 取7支干净试管（4-10），编号后分别加入0.3%NaCl的0.5%淀粉溶液2 mL，然后分别加入第一步中配制的PH5.4-8.0的 Na2HPO4—柠檬酸缓冲溶液3 mL，37℃恒温水浴10min后，先往4号试管中加入2ml稀释过的唾液，摇匀后并开始计时，此后每隔1min向下一个试管中加入2ml稀释后的唾液并摇匀，均放入37℃恒温水浴中，待各试管均加入唾液后，等计时到达最佳保温时间，将4号试管取出并滴入一滴碘液，混匀后观察颜色变化，此后每隔一分钟按刚才加入唾液的顺序将试管依次取出，均加入一滴碘液，混匀后观察颜色变化，并做记录。所加试剂