兽医生物制品学第五章抗体工程技术.pptVIP

目前治疗性抗体产品：精制破伤风毒素、精制白喉毒素、精制肉毒毒素。 绿脓免疫血浆抗体制剂 ★ 由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体，称单克隆抗体 盐析沉淀 用中性盐类使蛋白质从溶液中沉淀析出的过程称为蛋白质的盐析作用。 沉淀蛋白质所需盐类浓度视蛋白质种类而异。 常用的有：硫酸铵、硫酸镁、氯化钠 蛋白质是亲水胶体，当加入适量的轻金属盐类时蛋白质分子即处于高渗透压的溶液中，使蛋白质外周水化膜被破坏，同时盐类的离子中和了蛋白质分子的电荷，结果蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀。 但此时蛋白质分子内部的结构没有改变，仍然保持其天然蛋白质的性质，即可复溶解于原来的溶剂中。 （三） 细胞融合 融合过程须注意问题 1、细胞比例：骨髓瘤细胞与脾细胞比例为1：4 2、反应时间：混合细胞的离心管中30s内加入1ml 37℃预温的50％PEG，边加边轻轻摇动离心管，作用90s，然后加入预温的37℃的DMEM不完全培养液终止PEG作用，800r/min离心6min，弃上清。 3、培养液成分 （四）筛选和克隆 有限稀释法(稀释至0.8个细胞/孔) （五） 单克隆抗体的制备和冻存 （六） 单克隆抗体的纯化 （制备方法：体内培养、体外培养） （盐析、凝胶过滤、离子交换层析、 亲和层析、酸沉淀） ★四 、McA制备的基本方法 ★五 、单克隆抗体的应用 1、作为亲合层析的配体 2、 作为生物治疗的导向武器 3、 作为免疫抑制剂 通过亲和层析可从复杂的混合物中分离、纯化某一特定成分 McAb所带药物只作用于靶组织器官 抗人的T淋巴细胞单抗用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应 4、作为研究工作中的探针 5、增强抗原的免疫原性 6、作为医学检验试剂 （1）诊断各类病原体 （2）肿瘤特异性抗原和相关抗原检测 （3）检测淋巴细胞表面标志 （4）机体微量成分的测定 CJ PEB1重组蛋白的表达及单克隆/多克隆抗体的制备鉴定 课题的思路及目的 诱导培养基因工程菌E.coli BL21(DE3) 高效表达CJ PEB1重组蛋白 镍琼脂糖层析柱纯化 表达后的重组蛋白 免疫BALB/C小鼠制备单抗 免疫新西兰兔制备多抗 为建立血清学方法 检测CJ创造条件 PEB1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 常规免疫BALB/C小鼠制备单克隆抗体 -a -b -c -d -a -b -c -d 抗原决定簇 BALB/C a b b c d 脾脏产生各种 B 細胞 与佐剂乳化 免疫 采血收集血清作为筛选时阳性对照 无菌取脾脏收集B细胞 抗原通常有多个抗原决定簇 免疫后 的脾脏 约在两月內 注射四次 PEB1蛋白 -d -a -b -c -d PEB1 蛋白 ELISA HAT PEG 细胞融合 杂交瘤细胞 （亚克隆） (确定只有单个细胞) -d -c -b -a -d SP2/0 骨 髓 瘤 细 胞 B cell 脾 细 胞 培养筛选 只识别一个抗原决定簇 a b b c d 合混胞细 选筛 抗单 运用小鼠单抗分型试剂盒确定杂交瘤细胞所分泌的单抗的亚型。 将建株的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔诱生腹水。 应用间接ELISA法和双向琼脂扩散试验检测的腹水中单抗的效价。通过Western-blot和玻片凝集试验检测单抗的特异性。 三、PEB1蛋白多克隆抗体的制备及鉴定 免疫新西兰兔制备多克隆抗体。 1 2 3 4 1 2 4 3 1 2 3 4 PEB1 蛋白 与佐剂完全乳化 待血凝完全离心收集血清 盐析法粗提兔IgG抗体 应用间接ELISA法和双向琼脂扩散试验检测多克隆抗体抗体的效价。 通过Western-blot和玻片凝集试验检测多克隆抗体的特异性。 结果 一、SDS鉴定纯化后的PEB1蛋白 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 图1. SDS–PAGE鉴定纯化后的PEB1蛋白 表达的蛋白通过镍琼脂糖凝胶层析柱纯化后，经SDS鉴定，蛋白质分子量大小与预计的理论值相符，和本室前期的研究结果一致， PEB1重组蛋白纯度高 。 1～2：咪唑浓度为50mmol/L时洗脱的蛋白 3～4：咪唑浓度为100mmol/L时洗脱的蛋白 5～6：咪唑浓度为200mmol/L时洗脱的蛋白 M ：蛋白质标准分子量 7～8:咪唑浓度为300mmol/L时洗脱的蛋白 9～10:咪唑浓度为400mmol/L时洗脱的蛋白 97.4kd 66.2kd 42.7kd 31kd 14.4kd 单克隆抗体的获得及鉴定 细胞克隆的形成和杂交瘤细胞的筛选 图2. 融合后第二天骨髓瘤细胞对照孔 图3. 融合后第二天