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9 快速检验

第一节 酶法 一、肠球菌的检验 二、溶血性链球菌的检验 三、大肠菌群和大肠杆菌的检验 四、沙门氏菌的检验 五、志贺氏菌的检验 六、李斯特菌的检验 七、产气荚膜梭菌的检验 八、副溶血性弧菌的检验 第一节 酶法 许多微生物能产生特异性的酶,虽然是特有,但有一部分微生物可能具有相同的酶,这样即可将这群微生物与其他微生物区别开来,可用于初筛。 一般利用特异性酶的底物与显色物质或产生荧光的物质结合。当遇到产生有关酶的微生物时,显色物质或产荧光物质被释放出来,通过肉眼直接观察或在紫外灯下观察,判断结果。 尽管这种方法不能百分之百地准确,有少数变异菌株属例外,但大多数情况下能满足快速检验的要求。可避免进一步培养和生化鉴定。 常用的方法如下: 色原(荧光)糖苷结合物+糖苷酶→糖苷+色原(荧光) 色原(荧光)氨基酸结合物+氨肽酶→氨基酸+色原(荧光) 酶法检测常使用的底物如表。 表9-1酶法检测常使用的底物及应用 常用的呈色色原和荧光物质 常用的呈色色原有: α-萘酚、β-萘酚、邻硝基酚、对硝基酚、对硝基苯胺、酚酞、2-氨-4-硝基苯、吲哚基系列物质等。 常用的荧光物质:有4-甲基伞形酮(4-甲基-伞形基- β-D-葡萄糖醛酸苷,4-MUG), 一、肠球菌的检验 在肠球菌的检验中初筛选使用焦骨酰基氨肽酶(吡咯烷基芳酰胺酶,PYR)、亮氨酸氨肽酶(LAP)。大多数肠球菌二者皆阳性。利用此二酶可区分β-溶血性链球菌、明串珠菌、魏斯氏菌(Weissella,原属明串珠菌的一部分)和片球菌。个别肠球菌(如解肠球菌、盲肠肠球菌和鸽肠球菌)为PYR阴性。某些链球菌(酿脓链球菌和类似于肠球菌的个别菌株)为PYR阳性,但其他链球菌为阴性。片球菌为PYR阳性、LAP阴性。明串珠菌为PYR阴性、LAP阴性。使用的底物有L-焦谷氨酸-7-氨基-甲基香豆素、 L-亮氨酸-7-氨基-甲基香豆素、 L-亮氨酸-7-氨基-甲基香豆素盐酸。 除使用以上两种酶外,肠球菌检测中还经常使用的酶是。使用的底物是5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖吡喃糖苷。分解后产生蓝色菌落。酿脓链球菌不产生此酶,而产生此酶的菌都被叠氮化钠抑制。经试验明串珠菌、乳酸乳球菌乳亚种、气球菌属的有些种也产此酶。 二、溶血性链球菌的检验 在溶血性链球菌的检验中也使用吡咯烷基芳酰胺酶。酿脓链球菌、肠球菌、气球菌此酶阳性。使用底物为L-吡咯烷基- β-萘酰胺,在酶作用下,放出β-萘胺。 β-萘胺与N,N-二甲基肉桂醛作用变成深红色。已有检验用试纸条产品。 98%的A群链球菌、96%的肠球菌分解L-吡咯烷基- β-萘酰胺。 98%的AB群链球菌,100% A、B、D群以外的链球菌,82%的草绿色链球菌, 100% D群外的肠球菌吡咯烷基芳酰胺酶阴性。其他吡咯烷基芳酰胺酶阳性的有葡萄球菌、肺炎链球菌。 三、大肠菌群和大肠杆菌的检验 近年来大肠菌群和大肠杆菌的检验中已广泛应用β-D-半乳糖苷酶和β-D-葡糖醛酸苷酶。在大肠菌群检验中检测β-D-半乳糖苷酶。该酶看将乳糖分解,底物一般使用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖吡喃糖苷。该物质被分解后变成蓝绿色,指示大肠菌群存在。大肠菌群产生的β-D-半乳糖苷酶也可用以下底物检测:邻硝基酚- β-D-吡喃半乳糖苷酶(ONPG),6-氯-3-吲哚氧基-吡喃半乳糖苷, 5-溴-6-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷,8-羟喹啉- β-D-半乳糖苷,4-甲基伞形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷, N-甲基吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷, 6-溴-2-萘-β-D-吡喃半乳糖苷。 在大肠杆菌检验中检测β-D-葡糖醛酸苷酶。该酶催化β-D-吡喃葡糖醛酸与色基结合物水解成相应的苷配基和β-D-葡糖醛酸。但EHEC(如O157:H7)不具此酶。有用4-甲基伞形酮基-β-D-葡糖醛酸苷为底物的。该化合物经酶作用产生4-甲基伞形酮和葡糖醛酸。 4-甲基伞形酮在366nm下产生蓝色荧光。 四、沙门氏菌的检验 在沙门氏菌检验中使用辛酸酯酶。一般使用4-甲基伞形酮-辛酸酯或β-萘酚辛酸酯为底物。辛酸酯酶将以上底物分解产生4-甲基伞形酮或β-萘酚。4-甲基伞形酮在366nm下产生蓝色荧光。β-萘酚与固蓝反应产生红色或紫红色物质。该反应纸片上完成,5min出结果。此法由王金良等首创。使用的其他底物有5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-辛酸酯和X-辛酸(5-溴-4-氯-3-吲哚基辛酸) 福氏志贺氏菌、产气肠杆菌、普通变形杆菌、摩根氏菌、不动杆菌等。辛酸酯阳性的还有个别大肠杆菌、黏质沙雷氏菌、铜绿假单胞菌等假单胞菌、气单胞菌和邻单胞菌。 有的沙门氏菌选择性培养基中(ABC琼脂)测定β-D-半乳糖苷酶和α-D-半乳糖苷酶。使用的底物是3,4-环己烷(烯)七叶亭-β-D-半乳糖苷和5

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