第四章 目的基因.ppt

第四章 目的基因 基因的获取、克隆与鉴定 无论是确定某基因的表达调控机制和生物学功能还是建立高效表达系统，构建有价值的基因工程菌（细胞），亦或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后再输入回细胞改良生物体的遗传性状，前提是：从生物体基因组中分离克隆目的基因。 单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，除少数例外，绝大多数基因难以直接分离得到。 为了解决这个难题，一种可行的方法就是将DNA进行扩增，增加成功分离目的基因的可能性。然后再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来，最后分离得到目的基因。 获得目的基因的方法：建立基因文库、聚合酶链式反应（PCR）、化学合成法。 §4.1 基因组文库的构建 基因文库（gene library）又称DNA文库，是指某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体)，所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。 基因文库由外源DNA片段、载体和宿主组成。 按照外源DNA片段的来源，可将基因文库分为基因组DNA文库（genomic DNA library）和cDNA文库（complementary DNA library） 基因组DNA文库包含某种生物基因组全部遗传信息的一系列DNA片段，通过克隆载体贮存在一种受体菌的群体之中，这个群体称为这种生物的基因组文库。 cDNA文库：某生物基因组经转录和反转录产生的各种cDNA片段分别与合适的克隆载体连接，通过转化贮存在一种受体菌的群体之中。把这种包含某生物基因组全部基因cDNA的受体菌群体称为该生物cDNA文库。 一、构建基因组文库流程 （1）分离纯化基因组DNA。 （2）制备全部基因组的DNA片断； ①机械断裂法（用超声波或高速搅拌DNA溶液） ②限制性内切酶降解（鸟枪法） （3）DNA片断与载体的连接包装； （4）侵染宿主细胞； （5）重组克隆的挑选和保存。 二、鸟枪法克隆基因的基本战略 1.鸟枪法克隆基因的策略 （1）染色体DNA的切断： 超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端 全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控 部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整 （2）与载体连接： 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体； （3）受体细胞： 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为转化受体细胞 ；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞； （4）筛选含有目的基因的目的重组子： 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立） 2.鸟枪法操作的改进 使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA 使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率 例如，已知某目的基因位于1.8kb的SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6 - 2.0kb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进行连接。 3.鸟枪法克隆目的基因的局限性 工作量较大，需要了解目的基因的背景知识； 不能获得的最小长度的目的基因； 不能除去真核生物目的基因的内含子结构。 三、利用质粒载体构建基因组文库 基因组DNA +粘性质粒 重组DNA 转化细菌 菌落 该法简单、快速、易于操作，但仅适合一些低等真核生物和原核生物。 四.??利用λ载体构建基因组文库 基因组DNA + λ噬菌体 重组DNA包装成噬菌体 感染细菌 噬菌斑 五、人工染色体构建文库 六、基因组DNA文库的质量标准 一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：基因组文库必须具有一定的代表性和随机性，更要便于筛选。 ①重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力； ②载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆； ③克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序； ④克隆片段易于从载体分子上完整卸下； ⑤重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。 文库的质量检测： 文库平均插入片段：PFGE电泳检测一定数目克隆子插入片段的平均值 插入效率：有插入片段的克隆在所监测的克隆中所占的比例 基因组覆盖度：文库中克隆覆盖基因组的范围 基因组覆盖倍数： ① 平均插入片段长