白细胞检测方法.doc

白细胞检测方法 人精液中白细胞计数的传统方法是用组织化学方法鉴定多形核粒细胞特有的过氧化物酶。虽然这种技术有相对易于操作的长处，但它不能检测已经活化并已释放其颗粒的多形核白细胞，也不能检测不含过氧化物酶的其他种类的白细胞，例如淋巴细胞，这类细胞可以通过免疫细胞化学方法进行检测。 (一)正甲苯胺过氧化物酶染色 1.试剂： (1)饱和NH4Cl溶液(250g/L)。 (2)50g/LNa2EDTA磷酸缓冲液(pH6.0)。 (3)正甲苯胺[1](0.25mg/ml)。 (4)30%H2O2蒸馏水溶液。 工作液含1ml试剂(1)、1ml试剂(2)、9ml试剂(3)和1滴试剂(4)。工作液配制后可使用24小时。 2.步骤： (1)将0.1ml精液与0.9ml工作液混合。 (2)振荡2分钟。 (3)在室温下放置20～30分钟。 (4)再振荡。 (5)过氧化物酶阳性细胞被染成棕色，而过氧化物酶阴性细胞不着色。 (6)用白细胞计数池重复计数200个白细胞2次，并估计过氧化物酶阳性和阴性细胞的百分比。 (二)免疫细胞化学法 人白细胞的所有类型表达一种特异性抗原(CD45)，可用一种适当的单克隆抗体检测。可以通过改变第一抗体的性质，来检测不同类型的白细胞，诸如巨噬细胞、中性粒细胞、B细胞和T细胞。 1.试剂： (1)Dulbecco磷酸盐缓冲液(PBS)：见表6-1。 表6-1PBS溶液的配方 CaCl2·2H2O0.132gKCl0.2gKH2PO40.2gMgCl2·6H2O0.1gNaCl8.0gNa2HPO41.15g加水至1L (2)三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲盐溶液(TBS)：配制10倍的储存液，在使用前1∶10稀释(表6-2)。 表6-210倍TBS溶液配方 Trizma碱60.55gNaCl85.2g加水，用1mol/LHCl调pH至8.6加水至1L (3)按照以下配方配制碱性磷酸酶底物并过滤：见表6-3。 表6-3碱性磷酸酶底物配方 苯酚AS-MX磷酸盐2mg二甲基甲酰胺0.2ml0.1MTris缓冲液，pH8.2*9.7ml1M左旋咪唑0.1ml快速红TR盐，用前加入10mg*1.21gTrizma碱溶于水中，用1MHCl调pH值至8.2，加水至100ml。 (4)第一抗体：编码为CD45的白细胞共同抗原的单克降抗体，为市场广泛销售产品。 (5)第二抗体：来自兔抗小鼠免疫球蛋白，其应用稀释度取决于抗体的滴度和来源(例如，DAKO公司生产的Z259抗体的稀释度为1∶25)。 (6)碱性磷酸酶：抗碱性磷酸酶复合物(APAAP)，其稀释度也取决于抗体的滴度和来源(例如，DAKO生产的D651复合物的稀释度为1∶50)。 2.细胞制备步骤： (1)1份液化的精液(约0.5ml)与5倍体积的磷酸盐缓冲液(PBS)混合，在室温下，500g离心5分钟。此步骤重复2次，并用PBS将细胞团重新混悬至精液样品的原体积。然后根据精子密度将混悬液用2～5倍体积的PBS稀释。取此细胞悬液2份各5μl于干净玻片上，空气干燥，固定并立即染色，或包在铝箔纸内，并储存在-7℃，待分析。 (2)空气干燥的细胞用纯丙酮固定10分钟，或者用丙酮、甲醇和37％甲醛的混合液(体积比为95∶95∶10)固定90秒。用Tris缓冲液(TBS)洗2遍，排掉液体。 (3)每份固定细胞上覆以10μl单克隆第一抗体，并在室温下于湿盒内孵育30分钟，然后用TBS洗玻片2次，排去液体。 (4)用10μl第二抗体覆盖细胞，在室温下放置于湿盒内孵育30秒，用TBS洗2遍，并排去液体。 (5)向每个样本中加入10μl碱性磷酸酶—抗碱性磷酸酶复合物(APAAP)，在室温下于湿盒内孵育1分钟，用TBS洗2遍，排去液体。 (6)为了强化反应产物，可用第二抗体和APAAP重复染色，每种试剂各孵育15分钟。 (7)用TBS洗细胞2次，排去液体，并与10μl碱性磷酸酶底物孵育18分钟。 (8)在发生碱性磷酸酶颜色反应之后，用TBS洗玻片，最后用苏木精复染几秒，在自来水下冲洗，并用水性固定液封固。 [1]国际癌症研究机构声明，正甲苯胺可能对人类有致癌的危险。 大头医生/ KKME---专业医学搜索引擎/