端粒相关蛋白在基因表达调控及细胞分化中的作用.doc

端粒相关蛋白在基因表达调控及细胞分化中的作用 研究端粒相关蛋白在细胞分化中对基因表达的调控关系，揭示端粒相关蛋白在细胞分化和去分化中的作用及相应机制。探讨端粒相关蛋白在胚胎干细胞、祖细胞、诱导型多能干细胞定向分化中的作用。阐明端粒长度在神经、心肌、生殖和造血系统等细胞分化中的调节机制。 研究 （1）端粒长度对细胞分化及基因组表达的作用:为研究端粒长度对细胞分化的影响，分别在整体动物水平和细胞水平进行探讨。①以TERC-/-不同代次的小鼠（端粒长度不一）为模型，研究这些端粒长度不等的小鼠在不同生长阶段的分化发育状况，以了解端粒长度在整体动物模型水平对分化的影响。②为更深入了解端粒长度影响细胞分化的机制，以ES细胞为研究模型，采用特异诱导方法，促使其定向分化为神经细胞、心肌细胞以及生殖细胞，在诱导分化过程中实时检测基因组表达以及端粒长度变化，对所发现的关键蛋白进一步重组，研究其对端粒长度以及细胞分化的调控作用。③利用前期工作得到的端粒长度不一的mES细胞系，包括TERC-/-小鼠mES细胞，用同样方法诱导细胞分化，在细胞分化的不同时间点检测基因组表达变化，以及这些终端分化细胞特异性基因表达出现的时间和功能方面的差异，了解端粒长度对mES细胞分化的影响及其在分化过程中对基因组表达的作用。并采用端粒酶营救方法进一步验证确认。 （2）端粒相关蛋白在细胞分化中的作用:①利用已有的TPP1/POT1敲除小鼠，探讨TPP1/POT1在终端细胞分化方面的作用机制。②通过上述有关新的端粒相关蛋白的分离鉴定，可能会发现一些与端粒长度调控紧密相关的新基因，在本部分实验中进一步研究和探讨这些基因在细胞分化中的作用及机制。结合已有报道以及我们前面研究工作中所得到的结果，挑选几个变化明显以及与端粒长度调节密切相关的基因(RAP1、POT1、Zscan4以及TERRA telomeric repeat-containing RNA)，以及课题组一最近筛选出来正在鉴定的一批端粒相关蛋白，例如YWHAG和DDX39。利用RNA干扰方法降低ES细胞中这些基因表达，检测这些基因对细胞分化的影响以及在这一过程中对端粒长度的调控作用。③将端粒相关蛋白表达下降的ES细胞进行4-8细胞注射，以在体内进一步深入探讨这些端粒相关蛋白对细胞分化的影响。 （3）端粒相关蛋白在人胚胎干细胞分化中作用机制的研究:为进一步探讨人ES（hES）细胞分化与端粒及其相关蛋白的相互调节关系，利用hES为研究对象，定向诱导hES细胞向造血细胞分化。在上述细胞分化不同阶段，实时监控端粒长度、端粒酶活性、TERT、TERRA、六种核心端粒结合蛋白的表达、亚端粒区异染色质变化等。与此同时测定mRNA及microRNA表达变化，以发现其与端粒相关蛋白之间的关系。人为改变端粒长度及相关蛋白表达，以研究其对hES细胞分化功能的影响，并探讨可能的介导因子或调控网络。重点探讨RAP1、TERRA与hES细胞干细胞特性维持、分化潜能的关系。比较hES细胞和终端分化血细胞之间RAP1所结合基因启动子的异同，以期发现对hES细胞具有重要作用的RAP1靶基因。而后，探讨RAP1及靶基因对hES细胞分化功能的影响，并寻找不同分化阶段细胞内与RAP1相互作用的非端粒相关因子，进一步分析其功能。 （4）端粒相关蛋白TPP1对人胚胎干细胞分化的作用：有鉴于小鼠细胞研究结果和我们的初步资料显示TPP1在增殖活跃的细胞极易受DNA损伤等因素的影响，我们将在hES细胞中强调下述问题：①TPP1在hES细胞分化中表达变化及其功能。在hES细胞分化过程中，用RNAi技术敲除TPP1表达，实时监测TPP1mRNA和蛋白水平及其功能，观察细胞干细胞特性的维持、自我更新、分化过程的改变等；采用ChIP方法检测端粒酶在端粒处募集的变化和端粒长度变化。②hES细胞在不同应急条件（化疗，放射线照射等）下TPP1的表达改变，重点研究DNA损伤信号是通过何种途径影响TPP1表达的，是否抑制TPP1对细胞功能产生影响，是否抑制DNA损伤监控通路活化能够增加TPP1的表达和功能，是否TPP1过表达能够逆转对细胞功能的不良影响。③TPP1过表达hES细胞对化疗、放射线照射的反应。通过导入外源性TPP1表达载体建立TPP1-hES细胞株，观察其对分化的影响，对化疗，放疗敏感性的变化，希望借此为今后细胞衰老和癌症的防治提供指导作用。 （5）端粒相关蛋白在免疫细胞分化中的作用：淋巴细胞的分化是和端粒酶活性和端粒长度的变化相关的。研究显示T和B细胞在分化过程中表现为明显的端粒酶活性降低和端粒长度变短，而T细胞的激活和克隆性增生需要端粒酶激活和端粒长度的维持；若T细胞进入衰老状态则伴有端粒的损伤。我们将研究端粒体及端粒酶对淋巴细胞分化、克隆性增生及衰老的调控作用。着重利