通过光控转基因系统对基因表达进行时间空间上的控制.docxVIP

光控转基因系统对基因表达的空间时间控制 我们开发了一种光控转基因系统，其基础是一种人工的，从基因上编码的光控反式作用因子。在哺乳动物细胞及小鼠细胞中，该反式作用因子在蓝光暴露下与启动子结合，并迅速启动目标基因的转录。这一转基因系统为从空间和时间上调控基因的表达提供了一种有力而便捷的方法，可以用来在活体系统中操纵许多生物学过程，并且带来的扰动最小。 可控的转基因系统是生物医学研究及生物技术中不可或缺的工具。在过去的十年间，化学调控的基因表达系统（1，2）被广泛用于从时间上调控基因的表达。但是，由于这些小分子诱导物可以自由地扩散，并且很难消除，所以想要在精确的位置和时间上精确地开关基因的表达是不可能的。光是一种理想的基因表达诱导物，因为它容易取得，高度可控，没有毒性，并且最重要的是，在时间和空间上具有很高的精确度。多细胞组织中，一个光控基因表达系统可以是从时间空间上精确控制基因表达的前途光明的工具。在光控基因方面，人们有过一些努力。开发出了受紫外线激活的笼式反式作用因子或化学诱导物，使得人们可以在胚胎发育时（in developing embryos[3~5]）进行基因功能的研究。红外线激光用于诱导热休克介导的转基因表达（6）。最近，发展出了通过基因上编码光敏子（7~11）从而用光照射来调控基因表达的人工方法。但是，使用这些方法的生物学家极少，这可能是因为技术上太复杂，或者有限制。我们试图开发一种简单有效的转基因系统，通过单个基因编码的光敏反式作用因子来进行直接调控。 为了创造一种光控开关的基因启动子系统，有必要首先设计一个DNA结合域，这个域由光激活。目前已经描述得很好的DNA结合域包括Gal4残基1~147，Gal4（147），由DNA识别成分和二聚作用域组成。移除掉二聚作用域就产生了Gal4（65），它含有Gal4残基1~65，实质上消除了与其同源DNA序列，也就是Gal（UASG）上游活化序列的结合（12）。Vivid（VVD）是最小的含有光-氧-电压（LOV）域的蛋白质，在蓝光的活化下，形成一种快速交换二聚体（rapidly exchanging dimer，13~15）我们推测某种Gal4（65）-VVD融合蛋白的DNA结合特性，可能是光控的，因为光应该能诱导融合蛋白的二聚作用，增强其与UASG序列的结合，激活转录，而移除光以后，应该会使二聚体逐渐分离，DNA分离并失活（Fig.1a）。事实上，电泳迁移率转移评估显示，Gal4（65）-VVD二聚体在15W m-2及以上恒定蓝光照射下发生二聚化，并与UASG序列结合（Fig.1b）。在黑暗或光照条件下，纯化的Gal4（65）-VVD与VVD（13）的光谱一致（Supplementary Fig.1）。这些数据提示融合蛋白中的VVD域正确地折叠了起来，并被黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）所限制，光照射诱导Gal4的二聚化及其与UASG的结合。 为了创造一个可以驱动光活化转录的系统，我们将不同的反式作用域连接到Gal4（65）-VVD的C端（Fig.1a and Supplementary Fig.2）。We tested their light-dependent impact on transcriptional activity of a firefly luciferase (Fluc) reporter driven by Gal4 binding sites upstream of a TATA box after transient transfection in HEK293 cells, illumination with 0.84 W m?2 460 nm peak light from an LED lamp for 22 h and measurement of expression.含有p65活化域（GAVP）或VP16活化域（GAVV）的反式作用因子都显示出了明显的光诱导指示基因转录，但在光暴露条件下，GAVP反式作用因子引起了大得多的基因表达（Fig.1c and Supplementary Fig.3）。VVD中Cys108突变成丝氨酸会如预期般阻断光诱导基因的表达（13）（Fig.1c and Supplementary Fig.3）。已经知道VVD中Cys71突变为缬氨酸会增强光诱导VVD二聚体的稳定性（14），根据VVD（13）的晶体结构，我们假设VVD中Gln56突变为赖氨酸，会与其它VVD蛋白的Asp68形成盐桥，使二聚体更为稳定。VVD域中这两种加强二聚体的突变，C71V和N56K，都降低了黑暗条件下的基因表达，而N56K，C71V双重突变（优化的GAVP，即GAVPO）会额外使得背景基因表达降到最低水平（Fig.1c and Sup