蛋白质生物化学课件五.pdfVIP

7.02 2001 年秋季 Ver1.02 版 蛋白质生物化学……课件五 I. 今天的实验安排 a） 准备并进行电泳 b) 讲解课件 内容 c) 准备并进行免疫印迹 d) 免疫印迹的封闭 II. 电印迹 a) 在电流的作用下使凝胶上的条带转移到膜上。 i) 在蛋白质生物化学（PBC）中使用的硝化纤维素膜对各种蛋白质都具有较高的亲和性。 ii) 有时也使用PVDF膜。 b) 由一个叫做Southern的人率先应用于DNA上。 i) Southern 杂交又称 DNA 印迹. 可用带有放射性同位素标记的寡核苷酸探针探测特异的DNA。 ii) Nnorthern 杂交又称 RNA 印迹. 同样其检测也通常由放射性同位素标记或经其他方法处理。 我们将在发育生物学（DEV） 单元学习。 iii) western 杂交又称 蛋白质印迹. 可由2种不同的方法进行检测： 1. 抗体法 (免疫印迹) 2. 放射性同位素标记蛋白法(Far western 杂交). c) 今天的实验安排: i) 做一个凝胶的三明治。参考实验手册上的画图。 ii) 放入含印记缓冲液的印迹槽内。 iii) 缓冲液的成分 1. 甘氨酸可推动蛋白质从凝胶中迁移出来。我们在哪里已学过它有此作用？ 2. 甲醇可帮助较小的蛋白质分子转移。 3. 同样三羟基氨基甲烷还是作为一种pH 缓冲液 d) 如何监测是否发生电转移? i） 如果成功转移的话，预染的标准蛋白就会在膜上有蓝色的条带出现。 7.02中推荐的方法。 ii) 丽春红S是一种可逆的染料. 呈红色,可以与蛋白质非特异性结合,可通过水或所使用的任何缓 冲液洗去。 e) 检测杂交 i) 用便宜的、含量丰富的蛋白质(脱脂奶粉(BLOTTO) or BSA)封闭膜上未结合蛋白质的位点，这样 用来防止下面步骤中使用的抗体非特异性地与硝酸纤维素膜结合（抗体也是蛋白质）。 ii) 加入与 目的蛋白质能发生特异性结合的一抗，并孵育。我们使用兔抗-β-半乳糖苷酶的多克隆 抗体 IgG. iii) 洗去多余的未结合的一抗。 iv) 加入能与一抗发生特异性结合的二抗，并孵育。 在这里，我们使用羊抗兔 IgG。这样处理有 两个目的： 1. 二抗与一种酶相联接 (在这里是碱性磷酸酶)， 由此我们可以清晰地看到显现出的条带。 2. 成倍的二抗与每个一抗结合，可使其表现的信号得到加强。 v) 洗涤尤为重要，除出滞留的二抗。 vi) 利用碱性磷酸酶对底物的作用进行检测。连接在二抗上的酶可使其底物转变成蓝色沉淀，由此 我们就能看到β–半乳糖苷酶的条带。 7.02 Fall 2001 Protein Biochemistry Recitation #5 1