L72P突变所致Ⅰ型遗传性高铁血红蛋白血症1例.docVIP

L72P突变所致型遗传性高铁血红蛋白血症1例 【关键词】 细胞色素b5类 细胞色素还原酶 高铁血红蛋白血症 突变 基因 聚合酶链反应 报告遗传性高铁血红蛋白血症(RCM)是由于b5R缺乏引起的一种常染色体隐性遗传性疾病,分为型和型。型又称单纯红细胞型,其酶缺陷仅见于红细胞,纯合子红细胞中b5R活性显著降低,血中MetHb含量增高,其主要临床症状为紫绀。笔者 应用 RTPCR、DNA序列测定及PCRRFLP 分析 等分子生物学技术,鉴定1例RCM型患者b5R基因的突变位点,结合以往工作对此突变进行探讨,分析我国人b5R基因的遗传多态性。 1资料与 方法 1.1病历简介患者,男性,34岁,福建省三明市人。出生后不久即出现口唇、指甲、颧部和耳廓持续性青紫。体检:无心肺疾病,生长发育正常。实验室检查:MetHb含量为40%(正常 参考 值1％),其b5R酶活性(Hegesh改良法测定)为0.42 U/g Hb[正常参考值成人(2.2±0.47)U/g Hb],经口服维生素C、维生素B2及静脉滴注美蓝,症状缓解。临床诊断:RCM型。先证者之弟,MetHb含量0.8 %,其b5R酶活性1.2 U/g Hb。 1.2试剂 还原性辅酶二钠盐(NADH,上海伯奥生物技术有限公司);噻唑蓝(MTT,美国Fluka公司);2,6二氯酚靛酚(DCIP,德国Merck公司);总RNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒和DNA提取试剂盒(德国Qiagen公司);反转录试剂盒(美国Promega公司);内切酶EcoR、BamH和Eco24(德国MBI公司);T4 DNA连接酶和Taq酶(上海Sangon公司)。 1.3引物设计依据b5R cDNA编码序列,其引物设计为: P1:5′GGGAATTCATGGGGGCCCAGCTCAGCACG3′ P2:5′GGGGATCCCCTCAGAAGACGAAGCAGCGC3′ P1的5′端含EcoR酶切位点,P2的5′端含BamH酶切位点。扩增片段长度为921 bp。针对72位密码子点突变的检测,设计用于套式PCR扩增的引物序列为: W1:5′ATCCAGCCCTCGAGTTCTTC3′ W2:5′ATGGACTCGAGAGGGGCTCT3′ W3:5′GATGACCAGGTCCACGAAGC3′ 1.4b5R聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定 1.4.1溶血液制备将正常人、杂合子及患者的抗凝血用生理盐水洗涤2遍,取压积红细胞与等量的1%Triton100溶液混合,4 000 r/min离心5 min,取上清,用Triton100调整其血红蛋白浓度为100 g/L。 1.4.2PAGE及b5R活性染色取溶血液8 μL进行PAGE,电压120 V电泳2 h。将凝胶浸在酶底物染色液(含MTT 0.5 g/L、DCIP 0.02 g/L和NADH 0.5 g/L的电泳缓冲液)中,37 15 min,进行酶活性染色。 1.5RTPCR用试剂盒提取白细胞中总RNA,经反转录后以cDNA为模板,以P1和P2为引物进行PCR扩增。PCR反应体系总体积为25 μL,反应参数为94 45 s→60 ℃ 45 s→72 ℃ 60 s,循环30次,72 延伸10 min。 1.6b5R cDNA的克隆及序列测定利用T4DNA连接酶将EcoR和BamH酶切的PCR产物连接到同样经EcoR和BamH酶切的M13载体上。形成的M13重组载体转染至大肠杆菌TG1。提取M13载体,经PCR扩增及酶切鉴定阳性克隆,然后选择阳性克隆的M13重组载体用荧光标记的M13通用引物进行测序。 1.7PCRRELP 分析 提取白细胞中的基因组DNA,取DNA 200 ng为模板,以W1和W2为引物进行第1轮PCR。PCR反应体系体积为25 μL,反应参数为94 5 min变性,94 60 s→60 ℃ 60 s→72 ℃ 60 s，循环30次,72 延伸10 min,扩增片断为1.2 kb。然后以上述PCR产物1 μL为模板,以W1和W3为引物进行第2轮PCR,扩增片断934 bp。取第2轮PCR产物10 μL用Eco24 酶切消化,酶切产物进行5％聚丙稀酰胺凝胶电泳。 2 结果 2.1b5R PAGE酶活性染色电泳图谱上正常人及杂合子血红蛋白带后均出现一蓝色区带,正常人的蓝色带比杂合子深,而患者未见此条带(图1)。 2.2b5R cDNA序列分析与正常人b5R cDNA序列相比,患者b5R cDNA第72位密码子存在CTC→CCC的点突变(图2)。同时通过对7例正常人和患者的b5R cDNA序列分析,发现我国正常人b5R cDNA第11位和第95位密码子存在同义突变,分别为GTC→GTG和CCA→CCC