细胞转染简介.pptVIP

当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。目前G418的这一特性已在基因转移，敲除，抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。 转染是否成功的影响因素很多，如需要转染的细胞类型（对于困难的细胞系尤其如此），需要被转染的分子（DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白质），转染试剂等。但无论在何种情况下，转染的成功均取决于转染效率、低细胞毒性以及重现性这几个要素。 1 细胞 （1）分裂细胞相比较非分裂细胞 （2）贴壁细胞相比较悬浮细胞 （3）传代次数 （4）细胞数量（融合率） 2 交叉污染 如果同一个实验室同时培养不同种类的细胞，那就有可能发生交叉污染，即使遵循最严格的分离操作规程这种情况也有可能发生。如有许多细胞系被HeLa细胞所污染。和其他细胞系之间的交叉污染不总是能通过镜检发现。如果有少量某种生长快速的细胞掺入到培养细胞种，几个月过后它们就会完全取代目标培养物。 3 载体DNA 一般原则：对纯化所得的载体进行质量鉴定。确定维持其正常功能的基因序列是否适合于您的细胞体系。在测定细胞体系的参数时，一定要选用一种已知具有功能的载体做对照。 （1）载体完整性 （2）载体制备物 4 组织培养试剂 一般原则：优化您的细胞生长条件。只使用新鲜配制的培养基和添加剂，并尽可能减少所用试剂的变更。 (1)基础培养基 (2)胎牛血清 (3)添加剂 5 转染方案 一般原则：建立一套适当的转染方案；首先从一种标准方案开始，然后通过改变试剂/DNA的配比和复合物的剂量进行优化。 （1）转染复合物的制备 （2）转染试剂/DNA配比（负载比） （3）转染复合物的加入 （4）形成转染复合物所用的稀释剂 6 时间进度 一般原则提示：要确保最终结果的成功；建立一个合适的时间进度进行转染实验以保证您所需要的目的蛋白能得到最佳表达。 （1）转染的开始 （2）培养基更换 （3）时间测定 谢谢指导！ * 分裂细胞往往要比静止细胞更易于摄取并表达外源DNA。因此对大多数转染操作而言，细胞都在转染当天或前一天种板。同样重要的是细胞在种板进行转染时不应处于过度生长的状态；此外，还常用促有丝分裂刺激物（如，病毒转化，生长因子，条件培养基，以及滋养细胞）来活化原代培养细胞。2.在转染效率方面贴壁细胞和悬浮细胞之间的差异显著。相对于贴壁细胞（如HEK，CHO），悬浮细胞（如HL 60，Jurkat）非常难以转染，可能是因为细胞间膜结构的差异，但目前还没有分子水平上合理机制的解释。 3.传代次数是指对一个细胞系进行分批传代的频度（通常在一个实验室范围内）。某些细胞系相比较其他细胞系而言较不稳定，可能会随着培养时间的延长而改变，视不同的细胞系和培养条件而定。因此名称相同的同一细胞系在生理学和形态学（以及转染能力）性质也可能会有很大的差异。一般而言，细胞在冻存复苏后的一两代之内或直到它们完全复苏之前都很难转染。4.只要培养基质（组织培养皿）尚有空间，细胞就会按指数规律分裂。对于正常细胞而言，细胞生长的速度受细胞密度大小的抑制（接触抑制），但癌细胞则不受此限制而会继续生长并可互相叠加。营养物质的耗竭以及代谢废物的积聚会影响所有的细胞生长。细胞会因受到营养物质匮乏的压力而不适于转染。报告基因的表达率与转染开始时的细胞数量和细胞健康以及细胞溶解之前的生长情况相关。 * 载体是否具有功能取决于它结构的完整性。转染效率受到质粒制备物的超螺旋结构和舒展结构之间比例、双螺旋断裂、核酸酶的降解，以及来自于储存和处理过程中的物理压力的影响。2各种载体是按照不同的方案在细菌体系中制备并纯化。制备产物中残余的污染物（如CsCl，内毒素）可能会影响转染效率。 * 培养基的成分包括营养物质（氨基酸，葡萄糖），维生素，无机盐，和缓冲物质。有些成分非常不稳定，因此如果在使用时不是新鲜，加入就可能会产生问题。配置时要使培养基务必避光保存；因为已知有一些组分和缓冲物质，如HEPES，当暴露于光照下就会分解产生细胞毒性物质。2血清是一种含有白蛋白、球蛋白、生长促进因子和生长抑制因子的极为复杂的混和物。采集血清所用动物的年龄、营养水平和健康状况可影响到血清中这些成分的数量和质量，从而引起显著生物学变化。3某些细胞的生长依赖于一些对生命力或细胞分裂必不可少的物质（如，生长因子，微量元素，必需代谢物和蛋白等）。 * 诸如转染试剂/DNA配比，离子强度，缓冲液pH值，以及温度等变量都会影响到转染复合物的组成和功能。质粒可用无菌水或TE缓冲液稀释。如果您要使用一种市售的转染试剂，就应当仔细阅读该试剂所提供的使用说明。在不含血清或其他蛋白的培