小鼠孤雌胚胎干细胞系的建立及生物学特性鉴定.pdf

小鼠孤雌胚胎干细胞系的建立及生物学特性鉴定1 银益飞，孙筱放，蒋永华，张文红，郑育红，孔舒，潘倩莹，廖宝平 广州医学院第三附属医院妇产科研究所，广东广州（510150 ） E-mail ：yinyifei2005@163.com 摘 要：目的建立合适的小鼠孤雌胚胎干细胞建系方法。方法 采用氯化锶联合细胞松弛素 B激活B6D2F1杂交小鼠卵母细胞，所获得的囊胚与桑椹胚分别用于孤雌胚胎干细胞的建系， 观察两者的建系成功率。结果 共建立了12株小鼠孤雌胚胎干细胞系，这些细胞SSEA-1抗 原阳性，SSEA-4,TRA-1-81,TRA-1-60表面抗原阴性，具有AKP活性,保持正常染色体核型， 体内外分化分别形成畸胎瘤和拟胚体。结论 采用囊胚和去透明带的桑葚胚建立孤雌胚胎干 细胞系获得成功，该方法为人类纯合子的胚胎干细胞建系提供基础,在自体细胞治疗领域中 具有潜在的应用价值。 关键词：孤雌激活，胚胎干细胞，氯化锶，细胞松弛素B ，小鼠 中图分类号：S811.4 1. 引言 胚胎干细胞可以诱导分化为特定的细胞，用于治疗糖尿病、帕金森氏病及心脏病等，近 期成为全球生命科学领域研究的焦点；但是这些分化细胞移植仍有可能发生免疫排斥反应， 其安全性与伦理性等问题限制了干细胞的临床应用。孤雌胚胎干细胞的建立不需要去创造或 破坏一个具有生命力的胚胎，不受伦理的限制；并且孤雌胚胎干细胞为单性来源，在组织器 官移植过程中减少了免疫排斥反应的发生，因此在细胞治疗，器官移植领域具有广阔的应用 前景。目前已建立了小鼠、猕猴、以及兔的孤雌胚胎干细胞系[1－3] ，但是人类孤雌胚胎干细 胞的建系研究尚无重大突破。本试验通过建立小鼠孤雌胚胎干细胞系，对建系过程中的影响 因素进行分析，为人类孤雌胚胎干细胞系的建立提供实验基础。 2. 材料和方法 2.1 材料 C57BL/6小鼠由南方医科大学实验动物中心提供（合格证号:检证字2005A044 ）， DBA/2 小鼠由中山大学实验动物中心提供（合格证号:检证字2006A004 ）；Scid小鼠由上海斯莱克 实验动物有限公司提供（合格证号:检证字SCXK(泸)2003 －0003 ）。PMSG(天津市华孚市 高新生物技术公司) ； HCG(瑞士雪兰诺公司) ；氯化锶（SrCI2 ）、细胞松弛素B （CB ）、 透 明质酸酶、链蛋白酶、明胶、2 －巯基乙醇（美国Sigma公司）；DMEM 、PBS 、胰酶、非必 需氨基酸、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、青霉素/ 链霉素（美国GIBCO公司）胎牛血清(美国Hyclone 公司),ESGRO(美国Chemicon公司) 。 2.2 方法 2.2.1 实验动物超排处理以及卵母细胞的收集： 8周龄(C57BL/6 x DBA/2) B6D2F1杂交雌性 小鼠3只。腹腔注射PMSG 10 IU ／只，48 h后注射HCG 10 IU ／只。注射HCG 16 h后脱颈椎 处死小鼠，取出输卵管，放人M2培养液中，划破输卵管膨大的壶腹部，收集颗粒细胞－卵 母细胞复合体，用0.1 ％ 透明质酸酶去除颗粒细胞后，将卵母细胞置于CZB液中，37℃、5 1本课题由广东省“十五”科技计划重大专项基金项目资助(项目名称：胚胎干细胞诱导为造血干细胞治疗白 血病的研究；项目编号: B30202) -1- ％ CO2培养箱内待用。 2.2.2 卵母细胞激活处理： 用不含ca2+、Mg2+ 的CZB配制含有10 mmol ／ml 的SrCI2 、5ug/ml 的CB 的激活液，将M Ⅱ期卵母细胞在该激活液中处理6h，再转入KSOM培养液滴中，37℃、 5 ％ CO2培养箱内培养4天，观察囊胚形成率。 2.2.3 小鼠孤雌胚胎干细胞的分离培养：培养至第四天的囊胚采用全胚培养法接种到小鼠胚 胎成纤维细胞饲养层上；桑椹胚先用0.1 ％链蛋白酶处理1－2分钟去除透明带，再转入饲养 层。原代培养6 －7天后，采用0.05 ％的胰蛋白酶37℃作用3分