海洋生物抗菌肽在枯草杆菌BS168中的高效表达_谢海伟.pdf

海洋生物抗菌肽在枯草杆菌BS168 中的高效表达 谢海伟, 文 冰, 王 娣, 钱时权, 杨贤松, 许 晖 (蚌埠学院 生物与食品工程系, 安徽 蚌埠 233030) 摘要: 为了实现基因工程高效制备tachyplesin Ⅰ, 采用tachyplesin Ⅰ基因串联表达的方法, 以穿梭表达 载体 pSBPTQ 为表达载体, 通过 RT-PCR 扩增 tachyplesin Ⅰ基因(tac) 和采用直接退火的方法合成 tachyplesin Ⅰ串联基因(2tac), 构建重组表达载体 pSBPTQ-TAC 和 pSBPTQ-2TAC, 转化到枯草杆菌 BS168 实现高效表达。实验结果表明: 基因tac 和2tac 在枯草杆菌中表达成功, TAC 和2TAC 抗菌肽表 达量分别约为 8.5 ％、15.8 ％, 经高效液相色谱分析表达产物在发酵上清液中的含量约为 5.46 、10.36 mg/L; 表达产物 TAC 和 2TAC 对大肠杆菌 K88 和金黄色葡萄球菌都具有明显的抑菌作用, 2TAC 经 BrCN 水解产物抑菌活力高于 TAC, 而 2TAC 的表达产量大约是 TAC 的 1.89 倍。这表明通过 tachyplesin Ⅰ串联表达产物降低了自身对宿主的毒性, 可以提高tachyplesin Ⅰ的表达产量。 关键词: 抗菌肽tachyplesin Ⅰ; 表达载体构建; 串联表达; 抗菌活性 中图分类号: Q786 文献标识码: A 文章编号: 1000-3096(2011)03-0055-09 马蹄蟹(Horseshoe crab)是一类远古的海洋节 [1] 1 材料与方法 肢动物。马蹄蟹血细胞中分离提取的一类抗菌肽 , 具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抑制肿瘤细胞增殖 1.1 材 料 和诱导癌细胞分化的生物活性[2] 。抗菌肽 1.1.1 菌株和质粒 tachyplesin Ⅰ因相对分子质量小不具备抗原性, 对原 克隆宿主菌 Escherichia coli. DH5α、大肠杆菌 核生物细胞有很高的杀菌活性, 对真核生物的正常 E.coli K88 、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus) 细胞则无明显毒副作用。抗菌时一般没有特殊受体, 为本室保存; 枯草杆菌 Bacillus subtilis BS168 为表 不会诱导抗药菌株的产生, 是一类具有巨大潜在应 达宿主菌, 由上海生命科学院植物生理与生态研究 用价值的抗菌肽。但由于马蹄蟹是一种珍贵的海洋 所惠赠; TA 克隆载体 pUCM-T 购自上海生工公司; 生物, 物种稀少, 是濒临灭绝生物, 且 tachyplesin Ⅰ 大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒 pSBPTQ[4] 由中山大学 的分离纯化过程繁琐且费用较高; 通过化学合成制 罗进贤教授惠赠。 备, 价格昂贵, 生物活性低; 因此采用基因工程制备 1.1.2 培养基和主要试剂 tachyplesin Ⅰ成为一种可行的方案[3] 。 马蹄蟹购自广东省深圳市水产品市场; 枯草杆 目前, 利用基因重组技术在体外大量制备活性 菌感受态制备用GMI 、GMII 培养基[5]; 发酵用MSR 多肽是生物制品研究的热点之一。对于分子质量较