第六章 生物酶工程.ppt

第二节 酶分子的改造 第二节 酶分子的改造 优点： ①同时进行多达5个点突变 ②采用高保真PfuTurbo? DNA聚合酶，确保扩增过程的高准确性， 无预期外的随机突变错误 ③快速简单的3步操作，一天内完成 ④每个突变位点使用一个带突变的寡核苷酸引物，节省引物费用 ⑤可使用简并寡核苷酸引物 ⑥含有高转化效率的XL-10 Gold? 超级感受态细胞 第二节 酶分子的改造 二、酶的定向进化 模拟天然酶的自然进化机制，在体外对酶基因进行改造，产生基因多样性，再通过定向筛选（选择）获取具有特定性质的突变酶的过程或技术，称为酶的定向进化 定向进化 = 随机突变 + 定向选择 第二节 酶分子的改造 （一） 酶分子定向进化的基本方法 酶定向进化的基本步骤： ① 通过随机突变和体外重组创造基因多样性； ② 导入适当载体构建突变文库； ③ 通过灵敏的筛选方法，选择阳性突变子。 第二节 酶分子的改造 第二节 酶分子的改造 1. 易错PCR 通过使用低保真度的TaqDNA聚合酶或改变PCR常规反应条件，如调整反应体系中四种dNTP的浓度（增加突变频率）、增加Mg2+的浓度（以稳定非互补的碱基对）、添加Mn2+ （降低聚合酶对模板的特异性）等，引起碱基以某一频率产生随机错配而引入多点突变，构建突变库，筛选所需突变体。 特点： 能够控制突变频率 缺乏重组机制，核苷酸序列分布的多样性不够 第二节 酶分子的改造 2. DNA改组 从正突变基因库中分离出所需的DNA片段，利用DNaseⅠ或超声波进行切割产生随机大小DNA片段，得到的随机片段在不加引物的多次PCR循环中，彼此之间互为模板和引物进行扩增，直到连接成为接近目的基因长度的DNA分子，然后再利用基因两端序列为引物扩增获得全长基因，这是来自不同基因的片段之间的重组。 第二节 酶分子的改造 特点： DNA片段得以重新组合，能在较短的时间内获得性能明显改善的酶蛋白，同时可使酶的两个或更多的已优化性质合为一体。 第二节 酶分子的改造 3. 随机引物体外重组法 以单链DNA为模板，利用一套随机序列引物进行PCR扩增，就可以产生大量和模板不同位点互补的短片段。由于碱基的错配和错误引发，这些短的DNA片段会含有少量的点突变。进一步PCR 反应中，它们之间可以相互同源引导和重组。组装成完整的基因长度，再利用末端序列为引物扩增得到全长基因。 第二节 酶分子的改造 4. 交错延伸法 是一种改进的或简化的DNA改组法，在PCR反应中，将含不同点突变的模板混合，加入单引物，进行多轮变性、短暂的复性/延伸，反复重复直到形成全长基因片段 （二） 酶分子定向进化的应用 1. 提高酶分子的催化活力 2. 提高酶分子的稳定性 3. 提高底物专一性 4. 改善酶的其它性能 第三节 融 合 酶 融合酶:将两个或多个酶分子组合在一起所形成的融合蛋白，称为融合酶 一、融合酶简介 生成融合酶的途径： ① 非理性设计，先构建库，再从库中筛选所需的融合体 ② 理性设计，在了解蛋白质的结构与功能的基础上，有针对性地实现几个蛋白质之间的交换和融合 融合酶构建策略：二级结构融合、功能域融合、整个酶蛋白的融合 第三节 融 合 酶 二、融合酶的应用 （一） 理论研究方面 1. 确定蛋白质结构与功能的对应关系 2. 确定蛋白质之间的相互作用 （二） 实际应用方面 1. 非催化特性的优化 2. 创造新催化活性酶 3. 研究酶及其它蛋白质的定位及移动 4. 在酶内部创建别构作用 5. 构建具有双催化活性的功能酶 思考题： 1、什么是酶基因的克隆，其基本步骤有哪些？ 2、酶基因克隆有哪些常用的方法？ 3、原核生物基因表达系统有什么特点？ 4、真核生物基因表达系统有什么特点？ 5、举例说明酶异源表达的应用 6、酶定点突变商业化试剂盒基本原理？ 7、酶定点突变常见有哪些方法？ 8、酶定点突变的概念、特点？ 9、酶分子定向进化的主要方法有哪些？ 思考题： 10、酶分子的定向进化有哪些方面的应用？ 11、试述DNA改组与交错延伸PCR的区别？ 12、什么是融合酶？ 13、融合酶的构建有哪些策略？ 14、融合酶有哪些方面的应用？ Enzyme Engineering 酶 工 程Enzyme Engineering 第六章 生物酶工程 第一节 酶基因的克隆和表达 一、酶基因的克隆 在体外将各种来源的目的酶基因与载体连接形成具有自我复制能力的DNA分子，即重组载体，然后通过转化或转染等方式将重组载体导入宿主细胞并培养，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取，从而获得大量所需酶基因。 第一节 酶基因的克隆和表达 DNA重组技术的发现 1972年，世界上第一个重组DNA分子诞生 1980年，获诺贝尔