慢性GVHD狼疮样小鼠肾组织CTGF的异常表达_0.docVIP

慢性GVHD狼疮样小鼠肾组织CTGF的异常表达 [摘要]目的：观察结缔组织生长因子（CTGF）在慢性移植物抗宿主病（cGVHD）狼疮样小鼠肾组织中的表达情况。 方法 ：参照有关 文献 建立cGVHD狼疮样小鼠模型。按随机设计原则将模型小鼠分成模型组及正常对照组,每组6只。CTGF蛋白检测采用免疫组织化学及免疫荧光组织化学法，CTGFmRNA表达采用RTPCR法检测；留取24 h尿，测定尿蛋白排泄率。结果：模型组小鼠24h尿蛋白总量明显高于正常对照组小鼠(P 0.01)；RTPCR检测到模型组小鼠肾组织CTGFmRNA表达较正常对照组小鼠明显升高(P 0.01)；免疫组织化学及免疫荧光组织化学表明，正常对照组小鼠仅在少数肾小管有微弱CTGF表达，而模型组小鼠肾小管及间质均可见CTGF蛋白显著表达。结论：cGVHD狼疮样小鼠肾组织中CTGF蛋白及mRNA表达明显上调，可能在狼疮肾炎肾小球硬化及肾间质纤维化的进程中起重要作用。 [关键词]慢性移植物抗宿主病；狼疮肾炎；结缔组织生长因子；小鼠 　 系统性红斑狼疮（systemic lupus nephritis，SLE）是继发性肾小球肾炎最常见的病因之一，是一种自身免疫介导性炎症，以肾小球、肾血管和间质的损害为特征，后期可 发展 为肾小球硬化、纤维性新月体、肾小管萎缩和间质纤维化等。既往 研究 证实，转化生长因子β（transforming growth factor，TGFβ）在肾间质纤维化的形成和发展过程中起重要作用。近年来国内外研究又发现，结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）是TGFβ发挥某些生物学作用的下游调控介质，对肾细胞的分化、增生及细胞外基质的合成和降解具有显著的调控作用，其在各种类型肾脏疾病中的异常表达可能是引起患者肾组织纤维化的重要机制之一。作者通过构建慢性移植物抗宿主病（chronic graft versus host disease，cGVHD）狼疮样小鼠模型，观察CTGF在该模型小鼠肾组织中的表达情况，旨在探讨CTGF在狼疮肾炎（lupus nephritis，LN）发病中的作用。 1 材料与方法 1.1 实验动物8～10周龄雌性（C57BL/6J×DBA/2）F1杂交鼠（以下称杂交鼠）及6～7周龄DBA/2小鼠购自中山大学医学动物中心，体重 (20.17±1.20)g，清洁级。 1.2 模型的建立与分组 参考 文献[1]制作cGVHD狼疮样小鼠模型。取DBA/2小鼠脾脏、胸腺、淋巴结细胞，制成单细胞悬液（约60%脾细胞、30%胸腺及10%淋巴结细胞），于0、3、7、10d经尾静脉注射于杂交鼠，每次给予细胞数为50×106。按随机设计原则将模型小鼠分成模型组及正常对照组，每组6只。两组小鼠首次注射淋巴细胞后12周留取24h尿，处死小鼠，立即取下肾脏，一部分保存于-70以备提取mRNA，另一部分置于10％中性福尔马林溶液中固定，石蜡包埋后切片行组织病 理学 检查。 1.3 24h尿蛋白量测定用双缩脲比色法测定尿蛋白,小鼠尿液15稀释后按操作说明书操作。 1.4 RTPCR 1.4.1 总RNA提取 从-70低温冰箱中取出肾组织，迅速用Trizol（晶美生物技术有限公司）匀浆提取总RNA。取5μl总RNA进行甲醛变性凝胶电泳，紫外灯下观察5、18、28s条带清晰提示RNA完整无降解。 1.4.2 逆转录 逆转录反应体系如下：在PCR管中加入10×逆转录缓冲液1μl， MgCl2（25mmolL－1）2μl，Oligo dT1μl,dNTPs（10mmolL－1）2μl，RN酶抑制剂0.25 μl，AMV逆转录酶（Takara公司）1μl，总RNA2.75μl，30 10min后，42逆转录50min，99灭活逆转录酶5min，5 5min，所得cDNA保存于-20用于PCR扩增。 1.4.3 PCR扩增 CTGF及GAPDH内参照引物用DNA Club软件设计，由上海生工生物工程公司合成，序列如下：CTGF上游引物5′atgctcgcctccgtcgcag3′，下游引物5′tcaaagatgtcattgtccccag3′，产物为1007bp；GAPDH上游引物5′gtgggc cgctctaggcaccaa，下游引物3′ctctttgtatcacg cacgatttc，产物为452bp。PCR反应体系：5×PCR 缓冲液 10μl,MgCl2（25mmolL－1）4μl， dNTPs（10mmolL－1）1μl,上下游引物（10μmolL－1）各1μl，cDNA 模板1μl ，TaqDNA聚合酶（5Uμl－1）（Takara公司）0.25μl，补足双蒸水至50μl。Eppendorf A