抗果蝇Trio蛋白抗体的制备及鉴定_0.docVIP

抗果蝇Trio蛋白抗体的制备及鉴定 【摘要】 目的：制备兔抗果蝇Trio蛋白的抗体。 方法 ：以RTPCR扩增Trio的1 173 bp的基因片段并克隆入pET28a(＋) 和pGEX4T1 (His)6C表达载体中，表达并纯化TrioHis、TrioGST融合蛋白。用纯化的TrioHis融合蛋白免疫家兔产生抗Trio的抗体，用TrioGST亲和层析法进行纯化并采用Western blot法检测抗体生物学活性。结果：表达的TrioHis蛋白以包涵体的形式存在，用His亲和层析法分离纯化后得到较纯的TrioHis融合蛋白，以纯化的TrioHis免疫家兔制备的兔抗Trio的抗体，经Western blot 分析 显示该抗体可与果蝇S2细胞Trio特异性结合。结论：获得具有良好特异性的兔抗Trio抗体，为进一步 研究 Trio的功能奠定了基础。 【关键词】 Trio基因 原核表达 抗体制备 Trio基因是Dbl家族重要的一员，它编码的蛋白在人、小鼠、线虫、果蝇中具有高度的保守性。Trio能够活化Rho家族的GTPases，可能参与多种信号通路，已经发现它在轴突导向、神经细胞延伸和迁移中起着非常重要的作用，但该基因在果蝇中的功能尚不清楚 ［１］。本研究采用原核表达系统 ［２］制备并纯化了TrioHis融合蛋白，以纯化的融合蛋白免疫新西兰白兔获得抗Trio抗体，为进一步研究Trio蛋白的功能奠定基础。 1 材料和方法 1.1 材料 大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)由本实验室保存。质粒pET28a(＋)、pGEX4T1 (His)6C为Novagen公司产品；逆转录酶购自Promega公司，限制性内切酶、T4连接酶及高保真DNA聚合酶均为TaKaRa公司产品；小量胶回收试剂盒为TaKaRa公司产品；His亲和层析柱购自Clontech公司，CNBr活化的抗体纯化亲和层析柱Sepharose 4B为Amersham Pharmarcia公司产品；Western blot显影底物及BCA蛋白定量试剂盒均为Pierce公司产品,抗果蝇Tubulin抗体购自Sigma公司,HRP标记的羊抗兔IgG为Promega公司产品；雄性新西兰家兔体质量约2.5kg,购自本校实验动物中心。 1.2 方法 ［3］ 1.2.1 目的基因的扩增 从野生型黑腹果蝇幼虫中提取总RNA，并逆转录为cDNA进行PCR扩增。上游引物的序列为 5′GCGCGGATCCGCCAGCCCCGGCAAATGG3′，下游引物的序列为5′GCGCCTCGAGTTTGGTTGACAGGGGATTGG3′（划线部分分别为BamH、Xho 酶切位点）。PCR反应的参数为：94 预变性3 min；94变性30 s，53变性1 min，72 延伸1 min，共34个循环;最后72 延伸10 min。获得Trio 1 173 bp的基因片段。 1.2.2 重组质粒的构建与鉴定 PCR产物分别经BamH 、Xho 双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳。割胶回收酶切片段，与经同样酶切的质粒pET28a(＋)和质粒pGEX4T1 (His)6C于16 连接过夜。以连接产物转化大肠杆菌DH5α，并涂布于含相应抗生素[质粒pET28a(＋)为卡那抗性,终质量浓度为25 mg·L-1；质粒pGEX4T1 (His)6C为氨苄抗性，终质量浓度为50 mg·L-1]的固体培养基上，于37 过夜培养。挑阳性菌落，提取质粒，进行BamH 、Xho 酶切和测序鉴定，得到重组质粒pET28a(＋)-Trio和pGEX4T1 (His)6CTrio。 1.2.3 目的蛋白的原核表达及纯化 将经酶切和测序鉴定的重组质粒pET28a(＋)Trio和pGEX4T1 (His)6CTrio分别转入大肠杆菌BL21（DE3）中，于37 培养过夜。次日按150接种至1 L含卡那霉素（终质量浓度为25 mg·L-1）的新鲜LB液体培养基中，于37 振荡培养至细菌浓度的A600 nm约为0.6，加IPTG至终浓度为0.1 mmol·L-1，于37 诱导表达3 h，离心收集菌体。菌体用1×PBS(pH 7.4)重悬，经超声裂解后，以10 000 r·min-1离心10 min收集上清和沉淀。经SDSPAGE分析表明，表达的目的蛋白主要位于包涵体内。用缓冲液A(8 mol·L-1尿素、100 mmol·L-1 NaH2PO4、10 mmol·L-1 TrisHCl，pH 8.0)溶解包涵体，取上清于Ni2+NTA树脂层析柱中;用缓冲液B(8mol·L-1尿素、100 mmol·L-1 NaH2PO4、10 mmol·L-1 TrisHCl，pH 6.3)洗柱，直至A280 nm0.01;用缓冲