碱裂解法从E.coli中制备质粒DNA.pptVIP

质粒DNA制备 一、质粒简介 质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNA分子 其大小范围从lkb至200kb以上不等。 已经在形形色色的细菌类群中发现质粒. 这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。 质粒通过细菌间的接合作用，从雄性体转移到雌性体，是细菌有性繁殖的性因子． 1946年， Lederburg和Fatum发现的F因子是最早发现的质粒，F因子与高等生物细胞质中的染色体外遗传单位极为相似。 1952年，由Lederburg正式命名为质粒。 确切地说，质粒是细菌内的共生型遗传因子，它能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞表型，是比病毒更简单的原始生命。 质粒依赖于宿主编码的酶和蛋白质来进行复制和转录。通常，质粒含有编码某些酶的基因，这些酶事实上在一定的环境下对细菌宿主有利。 由质粒产生的表型包括对抗生素的抗性、产抗生素、降解复杂有机化合物，以及产生大肠杆菌素、肠毒素及限制酶与修饰酶等等。 质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术． 二、质粒特性 1. 分子相对小 在5kb左右，质粒较小，比较稳定，不易受物理因素的损伤，此外，较小的质粒一般有较高的拷贝数。 2. 含有高效的自主复制成分 质粒的复制与宿主细胞的繁殖不相关，在抑制细菌蛋白质合成时，细菌染色体DNA停止复制，但这种质粒可继续利用细菌原有的酶系进行复制 质粒含有复制起始点，此起始点及顺式作用调控元件组成一个复制子(replicon)，能利用细菌染色体DNA复制所用的同一套酶系统，在细菌细胞中独立地进行自我复制及转录。 根据所含复制起始区的不同，有些质粒的复制与宿主细胞染色体的复制同步，每个细胞只含有一个或几个拷贝的质粒，即处于“严密控制”。 有些质粒则处于“松弛控制”，每个细胞可含达15-20乃至数百拷贝的质粒。这类质粒在宿主细胞蛋白质停止合成(加入氯霉素)、染色体DNA停止复制的条件下，拷贝数继续增加至数千。 3.不相容性 利用同一复制系统的不同质粒不能稳定地和平共处，可称之为不相容质粒，当两个上述质粒被导入同一细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争。 由于质粒分子是从细胞内的质粒库中随机选取出来进行复制的，所以两个不同的质粒在一个单细胞中的拷贝数并不总能保持相同。最初在随机过程中产生的微小差异，将很快导致两种质粒在拷贝数上更严重地失衡。 在一些细胞中，一种质粒处于优势，而在另一些细胞中，与之不相容的另一种质粒却占尽上风。细菌生长几代之后，占少数的质粒将会丧失殆尽，在原始细胞的后代中可含有两种质粒中的任意一种，但不会兼而有之。 通过检查不同质粒在同一细胞中共存的能力，可以把它们分为若干不相容组。带有相同复制子的质粒属于同一不相容组，而带有不可互换成分的复制子的质粒则属于不同的不相容组。现已发现30多个这样的不相容组。 4. 转移性 在自然条件下，很多质粒都可以通过一种称为细菌接合的作用转移到新宿主内。 5. 选择的标记 质粒应带有一个或几个可供选择的标记，便于对转化株的筛选。 常用来作为标记的有氨苄青霉素抗性(ampicillin resistance，ampr)基因，此基因编码β—内酰胺酶，该酶能水解氨苄青霉素的β—内酰胺环使之失效，从而赋予细菌抗药性。 另一常用的抗药性基因为四环素抗性(tetracycline resistance，tetr)基因，该基因编码一种含399氨基酸残基的膜相关蛋白质，能阻止四环素进入细胞。 ampr基因或tetr基因若被外源基因插入，便失去相应的抗药性，便于分子克隆的筛选。 大肠杆菌的lac Z基因也常被用作为选择的标记，此基因编码半乳糖苷酶，能分解一种有色基因(x)与半乳糖以糖苷键连结成的化合物x-gal。 半乳糖苷酶 X-gal X + gal 无色 蓝色产物 半乳糖 若在含有X-gal的培养剂中，在乳糖操纵子(lac operon)诱导物异丙硫半乳糖苷(isopropylthiogalactoside，IPTG)的作用下，细菌合成半乳糖苷酶，分解X—gal，此菌落成为蓝色。 若lacZ基因被外源DNA片断插入而破坏，则不能制造半乳糖苷酶，菌落为白斑。 6. 限制性内切酶单一切口 在质粒复制子以外的部位具有一种或多种限制性内切酶的单一切口，便于外源基因的插入。 若这种单一的限制性内切酶位点处于选择标记基因的内部，外源基因片断插入后会导致该基因失活便于筛选。 三、常用质粒载体 1. pBR322 pBR322是一种