益气消积方含药血清对人胃癌NKN28细胞株的作用_0.docVIP

益气消积方含药血清对人胃癌NKN28细胞株的作用 【关键词】 胃癌; 血清; 肿瘤; 大鼠 　　益气消积方（Yiqi Xiaoji Recipe, YQXJR）是根据上海 交通 大学医学院瑞金 医院 中医科主任沈小珩教授十多年致力于肿瘤 研究 的临床经验，并结合临床实践 总结 而出的新一代抗癌复方，临床观察对胃癌有较好的 治疗 作用。本次实验采用益气消积方含药血清，温育体外培养的人胃癌NKN28细胞，通过甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）法检测细胞增殖抑制作用，研究该方对体外培养的人胃癌NKN28细胞生长的 影响 。 　　1 材料与 方法 　　1.1 实验材料 SD大鼠50只，雄性，清洁级动物，体质量（250±30）g，由上海交通大学医学院瑞金医院动物房提供；人胃癌高分化腺癌细胞系NKN28细胞，由上海瑞金医院消化内科实验室负责孵育提供；益气消积方主要由黄芪、全蝎和白花蛇舌草等组成，生药购自上海瑞金医院中药房，由中药房代煎，上海中药研究所实验室浓缩而成，含生药量为2.8 g/ml；RPMI1640培养液、胰蛋白酶为Gibco公司分装,批新生牛血清，杭州四季青生物工程材料研究所产品；MTT，上海实生细胞生物技术有限公司；二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide, DMSO），美国Fisher 科学 世界公司香港分公司产品；TE2000U多功能倒置相差显微镜，日本Nikon公司产品；MK3酶标仪，芬兰雷勃公司产品。 　　1.2 益气消积方含药血清的制备 　　1.2.1 含药血清的制备 选用正常SD大鼠36只，禁食12 h后，予益气消积方煎液灌胃给药。大鼠分为3个剂量组（每组12只）分别给药，给药剂量分别为，低剂量组1.17 g/kg，中剂量组5.85 g/kg，高剂量组11.7 g/kg，分别相当于60 kg成日用量的同倍、5倍、10倍。给药方式为每天分2次给药，即采用一次及二次重复（2 h后相同剂量重复给药一次）给药方法。连续灌胃3 d，第3天第1次给药2 h后再给药1次，1 h后，乙醚麻醉，无菌条件下腹主动脉取血，静置2 h以上，1 500 r/min，离心15 min，10 min后取血清，按灌胃浓度分别混合，56 ，30 min灭活，分装，－20 冰箱保存备用［1］。 　　1.2.2 大鼠正常血清制备 对照组SD大鼠14只用生理盐水灌胃，每只2 ml/次，2次/d，连续3 d。于第3天第1次灌胃2 h后再灌胃1次，1 h后，乙醚麻醉，无菌条件下腹主动脉取血，静置2 h以上，1 500 r/min，离心15 min，10 min后取血清，56 ，30 min灭活，分装，－20 冰箱保存备用。 　　1.3 细胞培养 NKN28细胞株常规培养于含10％新生牛血清的RPMI1640培养基（含硫酸庆大霉素0.025 U/ml）中，于37 、5％ CO2孵育箱中进行连续培养［2］。 　　1.4 倒置显微镜下细胞生长状态观察 上述培养细胞，去掉培养液，分别加入以上各组血清，在CO2培养箱中继续培养24 h和48 h，将培养瓶在倒置显微镜下作生长状态观察。 　　1.5 细胞抑制率的检测 取浓度为1×105个/ml处于对数生长期贴壁生长的人胃癌NKN28细胞，按1×104个细胞/孔的浓度接种于96孔培养板（200 μl/孔），放入37 ，5% CO2培养箱中培养24 h后取出，吸弃培养板上清后加入高、中、低浓度含药血清及空白血清，每种浓度设1/2、1/4、1/8、1/16四种不同比例，200 μl/孔，每种比例设6个复孔。放回培养箱中，使药物与细胞共同孵育48 h和72 h。取出培养板，向每孔加入MTT 20 μl，继续培养2 h后终止培养，小心吸去孔内上清，每孔加入DMSO 150 μl，再放回培养箱中培养30 min，使结晶物充分溶解之后，在酶联免疫检测仪570 nm处读取各孔光密度值（即OD值）。抑瘤率（％）=（1－OD实验组/OD对照组）×100［3］。 　　1.6 统计学方法 采用SPSS 11.5统计软件包进行数据 分析 ，计量资料以x±s表示，组间比较用单因素方差分析和LSD检验。 　　2 结果 　　2.1 人胃癌NKN28细胞生长状况 倒置显微镜下，对照组的人胃癌NKN28细胞可见贴壁生长，细胞形态呈梭形，胞浆均匀，细胞透明，相邻细胞生长融合成片；而经含药血清处理的各组细胞，24 h可见细胞由贴壁而脱落，至48 h脱落更明显，脱落细胞悬浮于培养液中，细胞形态变圆或不规则，细胞变暗。比较含药血清各组细胞生长状况，以高剂量组含药血清组作用48 h脱落最明显。说明益气消积方有抑制人胃癌NKN28细胞生长的作用，呈现一定的时间浓度依赖性。 　　2.2