工业微生物育种实验.doc

土壤中产α-淀粉酶筛选产α淀粉酶相对较高的菌株碘-淀粉法对菌株进行鉴定并紫外诱变从土壤中分离得到了产淀粉酶相对较高的解淀粉菌株α-淀粉酶α一淀粉酶可提高糖化率及酒精出酒率，降低甲醇含量，提高酒精质量，同时可提高设备利用率等。淀粉酶在面包焙烤过程中分解淀粉产生的可溶性糖被酵母转化成酒精和CO2气体，不仅能增加面包体积，同时还有改善面包表皮色泽、提高面包软度、延长保质期的作用，对面包冷却和冷冻也有重要作用。由于微生物数量多，繁殖快，工业生产主要采用微生物发酵法大量生产该制剂。 本实验通过平板涂布法从土壤中分离筛选产α淀粉酶相对较高的菌株通过利用碘-淀粉法对菌株进行鉴定并紫外诱变从土壤中分离得到了产淀粉酶相对较高的解淀粉菌株 恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、电磁力搅拌器（含转子）、低速离心机、移液管、玻璃棒、试管等。 1.3 培养基 牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g，pH调至7.2，121灭菌20 min 。 分离培养基牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g琼脂粉20g，pH调至7.2，121灭菌20 min，待冷却到50时倒平板。α—淀粉酶产生菌的筛选与鉴定 取2g土样溶于18mL无菌水中，稀释至10-4，分别取10-2、10-3、10-4稀释液0.1mL涂布于分离培养基中，于37℃恒温箱中培养48小时。在平板上菌落周围滴加碘液，测量水解圈大小（H）和菌落大小（C），挑选H/C最大的菌，接种到液体培养基中，37℃恒温箱中培养24小时。 1.4.2 紫外诱变 取对数生长期的发酵液稀释106倍，吸取0.1mL稀释菌液涂布于牛肉膏蛋白冻固体培养基，倒置于37oC恒温箱中培养48小时。 将培养至对数生长期的发酵液倾于无菌培养皿，置电磁力搅拌器上于超净工作台紫外灯下（距离30cm）分别照射5min、10min。将诱变菌株在红光下稀释100倍、1000倍，分别取0.1mL涂布于分离培养基，倒置于37oC恒温箱中培养48小时。 在长出菌落的周围滴加碘液，观察并测定水解圈大小（H）和菌落大小（C），并计算H/C比。 二、结果与分析 2.1 出发菌株的筛选结果 测定诱变前的平板菌落直径和变色圈直径，初筛出 5株HC值较大的菌株（结果见表 1），选出 1 株酶活性最强的菌株作为诱变出发菌株。 表1 5株较优良出发菌株的HC值 编号 1 2 3 4 5 菌落（C） 0.6 0.5 0.6 0.4 0.7 水解圈（H） 1.2 1.1 1.3 1.5 1.3 HC 2.00 2.20 2.17 3.75 1．86 根据表1的测定结果，菌株 4 的 HC 值最大, 选出该菌株作为优良出发菌株。.2 紫外诱变致死率结果 测定紫外诱变前后的细菌培养后的平板菌落数，计算出细菌致死率（结果见表2）。 表 2 紫外照射后细菌的死亡率（%） 照射时间 稀释度 平板菌落 细胞浓度 存活率 死亡率 min N1(个/ml) N1/N0（%） 1-N1/N0 5 10-5 125 1.25×108 47.2 52.8 10 10-5 95 9.5×107 35.8 64.2 根据表2的测定结果，随着紫外照射时间的延长，细菌致死率升高。.3优良突变菌株的筛选结果 测定诱变前后的平板菌落直径和变色圈直径，再从菌落中筛出 5株HC 值最大的菌株（结果见表3） 表3 诱变前后5株较优良出发菌株的HC值 编号 1 2 3 4 5 平均 诱变前 C 0.4 0.5 0.4 0.4 0.5 0.44 H 1.4 1.6 1.5 1.5 1.6 1.52 HC 3.50 3.20 3.75 3.75 3.20 3.45 诱变后 5 min C 0.3 0.3 0.2 0.3 0.2 0.26 H 1.0 0.9 0.7 0.8 1.0 0.88 HC 3.33 3.00 3.50 2.67 5.00 3.38 诱变后 10 min C 0.2 0.1 0.2 0.1 0.2 0.16 H 1.0 0.7 1.2 0.6 1.3 .96 HC 5.00 7.00 6.00 6.00 6.50 6.00 根据表3的测定结果，诱变前菌株3和菌株4的HC值最大；诱变后5min，菌株5的HC值最大；诱变后10min，菌株2的HC值最大。且各时间段最大HC值为诱变后10min 诱变后5min 诱变前 。对土壤枯草芽孢杆菌淀粉酶菌株进行紫外线诱变处理，得到 1 株较出发菌株酶活力高的优良变株（诱变后10 min，菌株2 ），该优良变株的HC值为7，分别较出发菌株、诱变后5min菌株5高出 86.7% 、40%，说明其为所需高产且酶活力高的目的菌株。由表2、表3结果可知，随着紫外照射时间的延长，细菌致死率升高，但