GFP融合蛋白进行蛋白质的亚细胞定位.ppt.ppt

蛋白质定位的方法 本节课的主要内容 蛋白质定位 绿色荧光蛋白 绿色荧光蛋白融合蛋白的构建 绿色荧光蛋白融合蛋白的检测 其它荧光蛋白简介 蛋白质定位 真核细胞具有复杂的亚细胞结构。每种细胞器都有一组特定的蛋白。 真核细胞除叶绿体，线粒体能少量合成蛋白外，绝大部分蛋白是在胞浆或糙面内质网合成，最终运至不同地点，形成成熟的蛋白质并行使功能。 译产物中很大一部分是以前体蛋白形式存在，往往有蛋白分子定位信号，可引导蛋白质在胞内定位。 蛋白质在细胞内的定位问题，是细胞生物学研究的中心问题，也是分子生物学研究的热门话题。理解某些蛋白质的定位从而分析探索其生物学功能，意义重大。 蛋白质定位 蛋白质的亚细胞定位常用方法： 蔗糖密度梯度离心；免疫胶体金标记；免疫荧光；与GFP构建融合基因表达融合蛋白；多糖序列分析等。 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP) 2008年诺贝尔化学奖 GFP的结构特点 GFP的发光机理 GFP的荧光特性 GFP的优点 GFP的改进 GFP的应用 2008年诺贝尔化学奖 日裔美国科学家 下村修 美国科学家 马丁·查尔非 美国华裔科学家 钱永健 诺贝尔奖委员会将化学奖授予美籍日裔科学家下村修、美国科学家马丁·沙尔菲和美籍华裔科学家钱永健三人，以表彰他们发现和发展了绿色荧光蛋白质技术。 2008年诺贝尔化学奖 下村修：于1962年在水母Aequorea victoria发现并分离得到GFP，并发现该蛋白在紫外线下会发出明亮的绿色。 马丁·查尔菲 ：证明了GFP作为多种生物学现象的发光遗传标记的价值，这一技术被广泛运用于生理学和医学等领域。 钱永健：让人们理解了GFP发出荧光的机制。同时拓展出绿色之外的可用于标记的其他颜色，使得同一时刻跟踪多个不同的生物学过程成为现实。 GFP的结构特点 一级结构 GFP由238个氨基酸残基组成 ,分子量为26.9kD GFP的生色团位于氨基酸序列64~69位 GFP的第65、66、67位氨基酸分别是丝氨酸、脱氢酪氨酸、甘氨酸，为构成GFP生色团的核心 GFP的结构特点 空间结构特点： 由 11 条β桶状结构(β- barrel) 绕成的一个圆柱体，直径约3nm，长约4nm。 一条α螺旋缠绕在圆柱体的轴位置 生色团附着在α螺旋上，几乎完美地包埋于圆柱体中心 这种方式被称为β罐 (β-can) 晶体结构 GFP的发光机理 GFP的生色团是GFP发出荧光的物质基础。 实质：由第65、66、67位的丝氨酸—脱水酪氨酸—甘氨酸形成对羟苯甲基咪唑环酮 GFP的荧光特性 GFP的最大吸收峰为395nm(紫外)，并有一个479nm的副峰(蓝光)；发射光谱最大峰值为509nm(绿光) 尽管450～490nm(蓝光)是GFP的副吸收峰，但由于长波能量低，细胞忍受能力强，因此更适合于活体检测。 GFP的荧光特性 GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似，因此为荧光素FITC设计的荧光显微镜滤光片组合同样适用于GFP观察。 GFP荧光极其稳定，在激发光照射下的抗光漂白能力比荧光素强，特别在450～490nm蓝光波长下更稳定。 GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，GFP荧光便立即得到恢复。而一些弱还原剂并不影响GFP荧光。中度氧化剂对GFP荧光影响也不大，如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等。 GFP的荧光特性 通过对GFP的结构和生化特性进行改造，已获得许多具有不同发射峰和激发峰的突变体，使GFP的荧光强度和作为报告基因的检测灵敏度大大提高。 项目 激发峰 发射峰 野生型（wt-GFP） 红移突变体RSGFP 黄绿突变体YGFP 蓝色突变体BFP 增强型突变体OGFP 半衰期短的突变体 395 471-490 513 385 385 488 509 502-511 527 445 510 507 GFP及其主要突变体的荧光特征 nm GFP的优点 易于检测 荧光稳定 无毒害 通用性 易于构建载体 可进行活细胞定时定位观察 易于得到突变体 GFP的改进 尽管GFP作为报告基因或分子探针有许多无可比拟的优点，但是野生型GFP（wt GFP）具有一定的缺点： GFP有两个激发峰影响了其特异性，并且长波激发峰强度较小，不易观察 GFP合成及折叠产生荧光的过程慢，蛋白质折叠受温度影响大，表达量较低 GFP在某些植物细胞中并不表达 GFP的改进 除去GFP基因中隐蔽型内含子 消除编码蛋白的积累 将GFP定位到特定细胞器中 改变碱基组分 更换GFP生色团氨基酸 插入植物内含子 增加增强子和更换强启动子 GFP的应用 蛋白质定位 作为报告基因