结核分枝杆菌抗原HBHA在耻垢分枝杆菌中的重组表达与鉴定.pdf

第 44卷第 4期第 406页 华 中科技大学学报 (医学版) V0I．44 No．4 P．406 2015年 8月 ActaMedUnivSciTechnolHuazhong Aug． 2015 结核分枝杆菌抗原 HBHA在耻垢分枝杆菌中的 重组表达和鉴定* 余 菲 ， 寻 阳 ， 田茂鹏 ， 李华秀 ， 朱可橙 ， 袁 野 ， 滕新栋 ， 范雄林 华中科技大学同济医学院附属协和医院，第一临床学院，武汉 430022 。华中科技大学同济医学院基础医学院病原生物学系，武汉 430030 摘要 ：目的 构建高效表达结核分枝杆菌抗原肝素结合血凝素 (HBHA)的重组耻垢分枝杆菌 。方法 针对结核分 枝杆菌 H37Rv株 HBHA 的编码基 因Rv0475设计特异引物 ，利用 PCR技术从细菌基 因组 中获取 目的基 因，并克隆人 pET一30b(+)载体构建重组原核表达质粒 pETHBHA，经 IPTG诱导 pETHBHA转化 的重组 E．coliBL21(DE3)细菌， Ni柱纯化携带 C一端 His标签的 HBHA蛋 白，并制备 鼠源多克隆抗体 。PCR扩增含 自身启动子和调节序列的Rv0475 基 因并克隆人大肠埃希菌一分枝杆菌穿梭载体 pMV261，构建重组分枝杆菌表达质粒 pMVHBHA，并经酶切鉴定证实后 ， 电转化人耻垢分枝杆菌，涂布含卡那霉素的7Hll平板 ，挑选抗性克隆并扩大培养 ，15 SDS~PAGE和Westernblot鉴定 重组耻垢分枝杆菌的表达 。结果 分别成功构建重组原核表达质粒 pETHBHA 和重组分枝杆菌表达质粒 pMVHB— HA；重组蛋 白HBHA在大肠埃希菌 中成功表达并纯化后 ，BCA蛋 白浓度测定试剂盒测定浓度为 1．9125btg／gL，用其 制备 鼠源多抗 ；证实 HBHA利用其 自身的启动子和调节序列在重组耻垢分枝杆菌 中表达 。结论 成功构建过表达 HB HA的重组耻垢分枝杆菌 ，为研究该蛋 白参与结核病 的致病机制和研发新型疫苗和诊 断试剂奠定 了基础 。 关键词 ：肝素结合血凝素 (HBHA)； 耻垢分枝杆菌； 结核病 ； 表达 中图分类号 ：R378．91 DOI：10．3870／j．issn．1672—0741．2015．04．007 RecombinantExpressionand IdentificationofAntigenHeparin—bindingHemagglutinin (HBHA)ofM ycobacterium TuberculosisinMycobacterium Smegmatis YuFei ．XunYang ．TianM aopengetal 1UnionHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430022，China DepartmentofPathogenyMicrobiology，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityof Scienceand Technology， Ⅱ 430030，China Abstract Objective ToestablishrecombinantMycobacteriumsmegmatis(M smegrnatis)strainhighlyexpressingantigen heparimbindinghemagglutinin(HBHA)ofMycobacterium tuberculosis(M．tuberculosis)．Methods ThegeneRv0475，encoding HBHA of^ tuberculosisH37RvstrainwasobtainedbvPCR andclonedintothevectorpET一30b(+)，toconstructtherecom— b