一种免疫磁珠结合优化选择性培养基布鲁氏杆菌检验方法.docVIP

一种免疫磁珠结合优化选择性培养基的布鲁氏杆菌检验方法 　　摘 要：目前布鲁氏杆菌的检测多采用分子学方法进行，但针对食品检测应更注重检测布鲁氏杆菌的活菌，这样才有追踪溯源意义。本文采用免疫磁珠法并结合使用增加赤藓醇、血清选择性培养基，可使布鲁氏杆菌检出限达到25CFU/mL 关键词：布鲁氏杆菌；免疫磁珠；优化选择性培养基 中图分类号：S85 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20160932027 布鲁氏杆菌，是马耳他热和波浪热的病原菌，每年患者人数不断增加，成为流行病学中高度关注的致病源。布鲁氏杆菌主要通过畜产品和皮毛加工及养殖接触传染，寄生于细胞内，引起机体免疫力下降，可以导致患者丧失劳作能力和流产等，是食源性疾病中增长较快的一类致病源[1]。目前活菌培养依然是最好的评价布鲁氏杆菌感染的方法，只要在标本中检出，就可以确定食品的安全性并对布鲁氏杆菌污染实现追踪溯源 1 材料与方法 1.1 Dynabeads M-280磁珠 （日本DYNAL社产） EDC solution 液；NHS solution液；BST溶液；MEST洗液；羊布鲁氏杆菌；羊布鲁氏血清；羊抗兔Ig；马血清；赤藓醇；白细胞介素2；胰蛋白；葡萄糖；烟酸；生物素；维生素B1；D-环丝氨酸 ；甲基乙醚；多黏菌素B；杆菌肽；放线菌酮；制霉菌素；琼脂粉 1.2 磁珠的偶联 将2mg 磁珠加入2mL Eppendorf管中，管中加入500uL MEST对磁粒子进行洗涤3次。加入EDC与NHS各2.5mg，调整反应体积为500uL，混匀后37℃恒温活化0.5h，用MEST洗涤除去未反应的活化剂，换管洗涤2次。再用BST液洗涤2次，分散到BST中。加入抗血清300 uL，调整反应体积为500uL，4℃偶联20h。用BST液洗涤4次，500μL保存液重悬偶联好的抗体磁珠 Dynabeads M-280 磁珠时用下列方法处理：取羊抗兔 Ig （G）0.5 mL，加1 mL PBS-Tween溶液混匀。离心，弃去上清液。再加1 mL PBS-Tween 液使磁珠重新分散悬浮其中。加羊布鲁氏杆菌免疫血清1mL，4℃垂直于水平面、旋转振荡18h。上磁，弃液体。消磁，用1 mL洗液清洗，重复清洗5次。洗净后免疫磁珠放4℃冰箱备用 1.3 选择性培养基配置 葡萄糖0.1g；赤藓醇 0.2g；胰蛋白?12g；氯化钠3g；马血清23mL烟酸 0.5 mg；生物素 0.2 mg；维生素B10.5 mg；D-环丝氨酸 321.5mg；甲基乙醚1：20000；多黏菌素B 1：4000；杆菌肽 1：25000；放线菌酮1：100000；制霉菌素10000单位；硫酸锌 2μg；氯化铜1μg；硫酸钴 2μg；三氯化铁27μg；三氯化铝10μg；用蒸馏水定容至1L，pH =6.8。将上述培养基取200 mL添加1.5%琼脂粉，制备成选择性培养基，其余分装成100mL/瓶选择性增菌液。上述培养基在115℃， 20min条件下灭菌备用 1.4 样品测试 将布鲁氏杆菌肉汤增菌后，用血球计数板法稀释到每毫升含菌1×103CFU/mL，然后取0.1 mL分别添加到100g牛奶、100g羊腿肌肉、100g水样品中，混匀成测试样 将上述样品分别称取25g于100 mL增菌液中，37℃、5%CO2条件下进行增菌培养24～48h 1.5 免疫磁珠富集 吸取1mL增菌液，放入含有5mg免疫磁珠管内，室温垂直旋转振荡20min。上磁架，固定磁珠，弃样液。加1mL 洗液复混后同前操作。清洗4～5次后，加100uL PBS-Tween液使免疫磁珠和目标混匀备用 1.6 选择性分离培养和计数 将免疫磁珠混匀后移入标准一次性平板内，倒入45℃左右选择性培养基，摇匀。或在预先铺好的选择性平板上采用涂布法涂布。将接好种选择性平板在37℃，5%CO2条件下培养24～48h，计数 1.7 培养结果和比较 挑取10株平板菌落，分别接种在生化管培养，符合以下生化反应的为羊布鲁氏杆菌：革兰氏染色-，触酶+，氧化酶-，葡萄糖-，半乳糖-，阿拉伯糖+，硝酸盐-，尿酶-，精氨酸-，H2S-，硫堇+，明胶-，吲哚-，MR-，VP-，枸橼酸盐-，甘露醇- 计算公式：布鲁氏杆菌=选择平板总菌落数×（阳性株÷10），结果见表1 2 讨论 布鲁氏杆菌的检测逐步被分子学检测所代替，但是不可否认分子学也存在着弊端，样品中即便存在布鲁氏杆菌的核酸但未必说明样品具有生物可传染性，经典的活菌培养法在确认布鲁氏杆菌的生物安全性上具有更可靠性 相比较，采用免疫磁珠联合选择性培养基法检测布鲁氏杆菌可以极大提高布鲁氏杆菌的检出限，这主要得益于优化