2015春 第四章 酶的分离纯化to students.ppt

* ⑴ 选柱 层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。一般来讲，层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等现象。一般柱长度不超过100cm，为得到高分辨率，可以将柱子串联使用。层析柱的直径和长度比一般在1:25－1:100之间。 ⑵ 装柱 除了购买预装柱（比如：高效液相层析柱）以外，常规层析柱需要自己填充。而柱子填充质量的好与差，是关系到柱层析法能否成功分离纯化物质的关键。 一般要求填料在柱内颗粒大小分布均匀，松紧一致，填料微孔中无气泡，不能分层，连接处无死体积，柱床体积稳定，在较高的工作压力下不坍塌变形、流速稳定等。否则要重新装柱。 在填充层析柱之前，对所要填充的材料需作一些预处理。可根据不同的材料作相应的溶胀、漂洗、再生、转型、脱气等。例如，将层析用的基质（如吸附剂、树脂、凝胶等）在适当的溶剂或缓冲液中溶胀，并用适当浓度的酸（0.5N～1N）、碱（0.5N～1N）、盐（0.5M～1M）溶液洗涤处理，以除去其表面可能吸附的杂质，用去离子水（或蒸馏水）洗涤干净，然后再用酸碱处理得到所需的离子形式，最后再用去离子水（或蒸馏水）洗涤至中性。 层析柱的填充是先关闭出水口，用溶剂灌注至1/3柱高，并使筛板下的“死体积”不存有气泡，再将处理好的填充材料缓慢地倒入柱中，以防止气泡存留在柱内，静置使其沉降，并放出过多的溶剂，为了避免分层，最好一次装完，如需分几次填充，则在二次填充前应先在已经沉淀的表面用玻棒搅拌后再倾注，重复这个过程，直至装到需要的高度。用溶剂彻底洗涤层析柱后使液面降到比层析床表面略高一点。最后在床面上铺一张圆形滤纸或尼龙布，以免加样时扰乱床表面。 ⑶ 平衡 柱子装好后，要用所需的缓冲液（有一定的pH和离子强度）平衡柱子。用恒流泵控制其流速（平衡与洗脱时的压力尽可能保持相同）。平衡液体积一般为2～3倍柱床体积，以保证平衡后柱子符合填充均匀、松紧一致和没有气泡的标准。如果需要，可用兰色葡聚糖2000在恒压下走柱，如色带均匀下降，则说明柱子是均匀的。 ⑷ 加样 加样量的多少直接影响分离的效果。一般讲，加样量尽量少些，分离效果比较好。通常加样量应少于20%的操作容量，加样体积应低于5%的床体积。对于分析性柱层析，加样体积不超过床体积的1%。上柱前，应先将样品溶解在溶剂里或对洗脱液透析，使样品溶液的浓度尽可能高些，以减少加样体积，使区带狭窄。当然，最大加样量必须在具体条件下多次试验后才能决定。 应注意的是：①样品溶液不能有沉淀出现，否则应过滤后再上样。②加样时应缓慢小心地将样品溶液加到固定相表面，尽量避免冲击填料，以保持填料表面平坦。③样品的粘度不能过大，否则会影响分离效果。 ⑸ 洗脱 洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱三种。 简单洗脱：柱子始终用同样的一种溶剂进行洗脱，也就是溶剂的种类、浓度、pH等都不变化。如果被分离物质的各组分在该溶剂和固定相中的分配系数较大，采用这种方法是适宜的。 分步洗脱：对层析柱进行洗脱时，当与柱子结合的一个组分被一种溶剂洗脱后，更换溶剂洗脱下一个组分，一种溶剂洗脱其中一种组分。这种用几种洗脱能力递增的溶剂进行逐级洗脱的方法称为分步洗脱。 梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小时，可以采用逐渐改变溶剂的性质，形成一个浓度、极性、离子强度或pH值等连续递增或递减的梯度，从而使各组分依次被洗脱，这种方法称为梯度洗脱。最常用的是浓度梯度，在水溶液中，亦即离子强度梯度。它的优点之一是能够减少拖尾现象。 由于影响柱层析效果的因素很多，洗脱条件的选择就尤为重要。在选择了洗脱方式后，同时还应注意洗脱时的速率。根据速率理论，我们知道流速的快慢将影响理论塔板高度，从而影响分辨率。因此，为了获得满意的分离结果，溶剂的流速务必恰当控制。除了洗脱方式、流速以外，还有温度、压力等条件的影响。总之，我们必须经过反复的试验与调整，才能得到最佳的洗脱条件。 ⑹ 收集、检测、合并及保存 洗脱下来的流出液用部分收集器来收集。每管的收集量不能太多，一般1mL-5mL/管。然后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定。根据测定结果，即可绘制出洗脱曲线（以管号或洗脱体积为横坐标，以每管溶液中样品的浓度或活性为纵坐标）。在合并一个峰的各管溶液之前，还要进行鉴定。例如，一个蛋白峰的各管溶液，我们要先用电泳法对各管进行鉴定。对于是单条带的，认为已达电泳纯，合并在一起。最后，为了保持所得产品的稳定性与生物活性，一般采用透析除盐、超滤或减压薄膜浓缩，再冰冻干燥，得到干粉，在低温下保存备用。 ⑺ 柱子的再生 柱层析的许多填料（吸附剂、离子交换树脂或凝胶等）经过适当方法的处理，又恢复其性能，可以反复使用多次，这就称为柱子的再生。各种填料的再生方法是不同的，详细操