0质粒DNA的提取定量酶切与PCR鉴定-第3实验室.docVIP

生物化学实验报告 姓 名： 学 号： 专业年级： 组 别： 第三组第3实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称 实验日期 2014-12-04 实验地点 合作者 指导老师 评分 教师签名 批改日期 实验目的 .掌握PCR基因扩增的原理和操作方法 2.掌握碱裂解法提取质粒的方法 3.了解紫外吸收法检测DNA浓度与纯度的原理、方法 4.学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作 二、实验原理1.PCR(多聚酶链式反应) 在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。 PCR一次循环的具体反应步骤为： A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链 B.退火逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃ 左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。 C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火延伸为一条双链。 2.质粒DNA提取与定量 (1)碱裂解法 基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异； 高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA变性； 当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心形成沉沉淀去除； (2)离心层析柱 硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，不吸附蛋白质、多糖等物质； 通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除； 低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱； (3)紫外光吸收法 1,物质在光的照射下会产生对光的吸收效应 2,而且物质对光的吸收是具有选择性的 3,各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱 4.质粒DNA的酶切鉴定： 限制性内切酶是DNA重组操作过程中所使用的基本工具。限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列结合，或是与其附近的特异位点结合，并在结合位点切割双链DNA。 5.琼脂糖凝胶电泳： 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度 DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动. DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系). 三、材料与方法（一）材料 PCR仪(BioRad MJ mini)，，DH5a菌株(pMD19-T质粒,含目的片段-绿色荧光蛋白GFP)】、无菌去离子水、2×PremixTaq、引物 2.质粒DNA提取与定量 仪器：恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf管、微量加样枪、离心管 材料：溶液P1（S1）、溶液P2(S2）、溶液P3（S3）、去蛋白液PE（W1）、漂洗液WB（W2）、洗脱液EB（Eluent)、含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5α 3. 质粒DNA的定量（紫外分光光度法） 仪器：比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪 材料：无菌去离子水、质粒ＤＮＡ 4.质粒DNA的酶切鉴定 仪器：1.5ml的EP管、微量加样枪、恒温箱 材料：无菌水、10×M酶切缓冲液Buf R、质粒DNA、Hind III (15U/ul)、EcoR I(12U/ul) 5.琼脂糖凝胶电泳 仪器：凝胶电泳系统、凝胶成像系统 材料：电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNA Marker 5000、电泳缓冲液 （二）实验步骤 PCR扩增 用微量加样枪分别加入6μl灭菌去离子水、12μl2×PremixTaq、1μl引物l引物l菌液） ↓ 待反应液集中于反应管底部，将反应管放到PCR仪上进行扩增 ↓ 将扩增后的基因用微量加样枪加到电泳仪的凝胶孔中 2.质粒DNA的提取与制备 取1.5ml培养物加入Eppendorf管中 ↓ 加入250μl 溶液S1，吹打，使细菌沉淀分散，彻底悬浮。 ↓ 加入250μl 溶液S2，颠倒6～10次混匀（不要剧烈振荡），直到溶液变得清亮. ↓ 加入400μl 溶液S3，立即温和混匀，室温放置3-5min。13000rpm离心10min，小心取上清