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PCR技术 PCR(polymerase chain reaction) 技术能够特异地扩增任何所希望的目的基因或DNA片段，故又称为体外基因扩增技术或DNA扩增技术。 PCR技术诞生 PCR技术的基本原理 PCR技术是模仿DNA在体内的复制机制，在体外扩增特异的DNA片段，是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。 PCR技术是在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。 PCR技术可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面 PCR相关的常用实验技术 基因组DNA的提取 PCR技术 电泳技术 DNA的提取 高分子量 高纯度 DNA提取原则 保证DNA结构的完整性 纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质 排除有机溶剂和金属离子的污染 蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度 排除其他核酸分子的污染 常用的DNA提取方法 有机提取法 无机提取法 吸附材料结合法 基因组DNA纯化试剂盒 DNA提取的基本步骤 材料准备 最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融 提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞） 组织细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解 含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集 细胞裂解使内容物释放 材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式： 　　　植物材料－－液氮研磨 　　　动物组织－－匀浆或液氮研磨 　　　培养细胞－－蛋白酶K 　　　细菌－－溶菌酶破壁 　　　酵母－－破壁酶或玻璃珠 高温温浴时，定时轻柔振荡 核酸分离、纯化 采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系 采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔 离心分离两相时，应保证 一定的转速和时间 针对不同材料的特点，在 提取过程中辅以相应的去 杂质的方法 核酸沉淀、洗涤、溶解 当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分 沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀 沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥） 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase。pH值为8.0，可防止DNA发生酸解 基因组DNA的检测 基因组DNA的检测 DNA浓度的测定：在波长260nm的紫外线下，1 OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50ug/ml，单链DNA或RNA为40ug/ml，单链寡聚核苷酸为20ug/ml DNA纯度的测定：样品在260nm和280nm的紫外吸收值的比值来估算核酸的纯度。DNA260/280约为1.8，RNA约为2.0。若样品中污染有蛋白质或酚，其比值将明显低于此值 核酸检测在PCR中的意义 核酸纯度的检测：从组织中及培养细胞中分离出的DNA/RNA纯度及完整性对许多分子生物学研究至关重要，如Northern印迹分析、cDNA文库的构建、体外翻译及反转录PCR等。 核酸浓度的测定：待测样本浓度太高，容易形成非特异性产物，浓度太低，可能会形成大量的引物二聚体。另外，普通PCR时，对待测样本浓度的要求不是很严格，只要凝胶电泳证明有所需的条带出现，即可定性。而定量PCR时，必须测定样本浓度。 引物设计通常遵守如下原则 A、引物与模板的序列要紧密互补。 B、引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。 C、引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。 D、引物长度通常在20－25bp,Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%，产物大小在100-250bp之间。 E、引物的3’端避免使用碱基A；引物3’端避免出现3 个以上连续相同的碱基。 F、为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。 探针设计通常遵守如下原则： A、探针位置尽可能地靠近上游引物。 B、探针长度通常在20－30bp，Tm值在65－70℃，通常比引物高5－10℃，GC含量在40%－70%。 C、探针的5’端应避免使用碱基G。 D、整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量。 一.不对称PCR(asymmetric PCR) 不对称PCR主要是在PCR体系中设计不同的引物浓度，两条引物浓度比为1：50或1：100，前12个循环两条模板等量扩增，之后低浓度引物消耗殆尽，其扩增产物减少以至于无；而高浓度引物介导产生的扩增产物（即单链DNA）逐渐增加，可得到大量单链DNA（ssDNA）用于直接测序。 二.反向PCR(inverse PCR) 反向PCR用于扩增已知DNA片段两侧的