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大鼠二次脑挫伤模型的建立 　　摘要：目的 尝试建立一种存在二次脑挫伤的大鼠模型。方法 成年SD大鼠，性别不限，随机分为三组：假手术组、一次脑挫伤组及二次脑挫伤组。利用自由落体打击装置，对一次脑挫伤组大鼠进行一次打击，二次脑挫伤组在初次打击基础上1h后不同部位进行二次打击；一次脑挫伤组分别于打击后0h、1h、2h后取材，二次脑挫伤组于第二次打击后1h取材。采用激光扫描共聚焦显微镜检测技术对脑挫伤周围C-FOS蛋白阳性细胞数进行观察。结果 大鼠脑挫伤后脑皮质挫伤区周围C-FOS阳性细胞显著增高（P 　　1.2方法 1.2.1动物分组及模型的建立 健康SD大鼠25只随机分为假手术组（5只）、一次脑挫伤组（15只）、二次脑挫伤组（5只）。一次脑挫伤组按照颅脑损伤后处死时间不同又分为一次脑挫伤0h、1h、2h三个亚组，每个亚组5只大鼠，二次脑挫伤组于第一次打击后1h于不同部位进行第二次打击，第二次打击后1h处死大鼠 1.2.2大鼠二次脑挫伤模型的建立 利用自由落体脑损伤模型打击器建立模型：大鼠用20%水合氯醛（350 g/kg）腹腔麻醉后俯卧位固定头部及四肢，除去头皮处鼠毛。用手术刀切开大鼠头部中线皮肤，切口后端以45°角分别向两侧剥离骨膜，充分暴露双侧顶部颅骨，分别在双侧人字缝前、矢状缝旁分别钻直径5mm圆形骨窗，保持硬脑膜完好，将撞杆头端置于骨窗硬脑膜外。一次脑挫伤组利用自由落体脑损伤模型打击器，以30g打击棒从25cm高度落下冲击撞针，造成大鼠左侧局部脑挫裂伤；二次脑挫伤组在一次脑挫伤后1h以同样方法形成右侧局部脑挫裂伤。假手术组采用同样麻醉及手术步骤，但不用打击棒打击动物头部，一次脑挫伤组不打击右侧骨窗，所有大鼠处死后均在大脑两侧进行取材 1.2.3激光扫描共聚焦显微镜技术检测细胞内C-FOS蛋白表达 建立大鼠脑挫伤模型后取不同时间点，用20%水合氯醛 （350mg/kg）腹腔麻醉大鼠，于剑突下横向沿胸壁左右向剪开暴露心脏，用平头穿刺针从心尖插入左心室，剪开右心耳，依次用生理盐水、4%多聚甲醛灌注，断头取脑，置于4%多聚甲醛后固定6h，30%的蔗糖脱水至脑组织下沉，OCT包埋。切片，厚度25μm。取冰冻切片，0.4%的Triton X100-PBS打孔15min，4℃血清封闭1h，加入C-FOS一抗4℃过夜，0.1% Triton X100-PBS洗涤5min×3次，加入荧光二抗，避光室温孵育2h，甘油-PBS封片，激光共聚焦显微镜 （Olympus FV1000） 扫描图片。红色荧光为C-FOS，代表C-FOS的阳性细胞 1.3统计学分析 Fos阳性以个数表示，用计算机图像分析系统 （200×）显微镜下分别记数，所有数值均用平均数±标准差（x±s）表示，组间、组内比较用？字2 检验，P 　　[5]Yang K，Mu XS ， Xue JJ ， et al.Increased expression of c-fos mRNA and AP-1 transcription factors after co rtical impact injury in rats[J].Brain Res，1994，664∶141. [6]Zhang Y，Widmayer M，Zhang B，et al. Suppression of post ischemic induced fos protein expression by an anti sense digonucleotide to c-fos mRNA leads to increased tissue damage[J]. Brain Res，1999，832（1-2）：112-116. [7]王娜，李林.创伤性脑损伤动物模型的研究进展[J].中国康复理论与实践，2009，15（10）：905-907. [8]杜安妮，石京山.创伤性脑损伤动物模型的新进展[J].现代医药卫生，2015，31（4）：526-529. [9]Feeney DM，Boyeson MG，Linn RT，et al.Responses to corticl injury：1， Methodolodg and local effects of contusions in the rat[J].Brain Res ，1981，211：67-77. [10]Marmarou A，Foda MA，van den Brink W，et al. A new model of diffuse brain injury in rats. Part：Pathophysiology and biomechanics[J]. J Neurosurg，1994，80（2）：301-31