分子杂交和Western.pptxVIP

第三章 核酸分子杂交;核酸分子杂交：具有同源性的两条核酸单链在一定条件下,按碱基互补配对原则形成完整或局部互补双链的过程。;一、分子杂交的原理;二、分子杂交（固液相杂交）;（二）种类和特征 1、硝酸纤维素膜（NC） DNA结合中等强度，但高盐浓度下可加速结合，并牢固，80~100μg/cm2 依靠疏水作用结合 非特异性吸附少，特异性结合强，背景干净，本底低 质地脆，韧性差，不能反复杂交 2、尼龙膜 结合能力强，350~500μg/cm2 依靠离子键结合 本底高，非特异性吸附多 质地韧，能反复杂交 ;三、应用;1、诊断基因缺失：血友病（缺乏Ⅷ因子）;3、基因表达分析;四、电泳;电场强度： 同样的分子电压越大，泳动越快，但过快易拖尾，一般为5v/cm。 离子强度（缓冲液）;3、指示剂;4、染色剂;加入方式： 直接加入到胶中（1％琼脂糖） 称1 g琼脂糖粉＋100 mlTAE（??定与缓冲液一致）; bp —1534 — 994 — 695 — 515 — 377 — 237;五、分子杂交的过程;;转移到固相支持物上;A.虹吸法;B.电转移法;C.真空转移法; 2、Northern blot;避免内源性RNase的污染;③变性电泳;3、斑点和狭缝印迹（Dot and slot blot）;（二）探针标记;3、标记物;4、标记方法;注意事项：;②随机引物法;注意事项：;③3‘末端标记法;注意事项：;P;5、探针的纯化;（三）固－液相杂交;杂交过程;预杂交液;杂交;;Western blot;三、过程;2、蛋白定量;;根据标准品绘制标准曲线;3、SDS－PAGE;浓缩原理：;+;5Ⅹ电泳缓冲液;聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（单丙）和甲叉双丙烯酰胺（双丙）聚合而成 聚合过程需要催化剂。;4、转膜;5、封闭;7、洗膜;10、显色;;生 物 芯 片;概 念;分 类;基因芯片（DNA微阵列）; 将大量探针分子固定于支持物(substrate)上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。 ;基 因 芯 片 流 程;芯 片 样 品 制 备;基 因 芯 片 的 应 用;基 因 芯 片 的 应 用 ;基 因 芯 片 的 应 用;蛋 白 质 与 抗 体 芯 片;发 展 趋 势