环磷酰胺与乙酰苯肼血虚造模比较以及四物汤的疗效实验.pdf

环磷酰胺和乙酰苯肼血虚造模比较以及四物汤的疗效实验 王锐 2002207129 ，02 中基七 摘要：为探讨环磷酰胺和乙酰苯肼造模的机理不同及优劣，并四物汤对血虚证动物的治 疗机理，掌握小鼠四诊的观察方法．用环磷酰胺和乙酰苯肼两种药物进行小鼠血虚造 模，并设置对照组，观察并记录小鼠四诊检测信息．利用四物汤对血虚小鼠进行治 疗．制作舌及舌苔，小肠，胃黏膜，肝脏，胸腺，脾脏病理组织切片并镜检，制作小鼠骨髓， 血液涂片并镜检，测定各组小鼠总抗氧化能力，小鼠肝组织基因 RT-PCR 检测．结果显示： 通过对病理组织切片的观察，发现环磷酰胺和乙酰苯肼对胃、小肠、肝组织均有损伤，但程 度不同。环磷酰胺组胃、小肠组织损伤程度较乙酰苯肼组严重，肝组织切片两者无明显差异。 肝组织基因 RT-PCR 检测结果，葡萄糖醛酸组未采纳，白蛋白组显示两个造模组小鼠肝组织 基因表达均有所抑制，但无明显差异。四物汤对乙酰苯肼致血虚的小鼠肝功能的改善有一定 作用。四物汤对于环磷酰胺所致血虚的小鼠是否有作用不明。 关键词： 环磷酰胺，乙酰苯肼，动物模型，四物汤，小鼠四诊． 血虚证是中医临床常见的证候群之一。制作血虚证动物模型的常用方法有射线照射、药 物诱发和放血等。本实验利用环磷酰胺和乙酰苯肼诱导制成实验性小鼠血虚证模型，并用中 药四物汤对乙酰苯肼造模组进行治疗．在实验过程中体会造模方法的应用，小鼠四诊的观测 方法，观察血虚模型组以及正常组和四物汤治疗组在病理组织，四诊，基因表达，抗氧化能 力方面的变化，进而比较两种化学药物的作用机制不同和作用效果优劣，评价四物汤在血需 动物模型治疗方面的疗效． 材料及方法 （一）动物及处理 实验选用昆明种雄性小鼠 40 只（平均体重约 25g ）。随机分成四组：正常组、环磷酰胺 组、乙酰苯肼组和四物汤组。每组 10 只，分笼饲养于内铺垫料的塑料笼，每组 1 笼。每天 自食足量普通颗粒饲料。 （二）药物及处理 1.造模药物。注射用环磷酰胺、乙酰苯肼，上海中医药大学综合实验室自备。 2.治疗药物。四物汤：生地、白芍、当归、川芎各 3g （上海中医药大学综合实验室采购）， 冷水浸半小时，煎取药汁后浓缩为 130ml。 3. 白蛋白RT-PCR 所用试剂。Torizol 液、氯仿、异丙醇、75%乙醇、5*buffer、DNTP （100mM）、 随机引物（100μg/μl ）、DTT （100mM）、Tag 酶、1.4%琼脂糖凝胶、DNAmarker 等 （三）造模 他组按有关文献公认步骤进行，略。四物汤组造模同乙酰苯肼组。 （四）治疗：灌胃给药。 第 1 日到第 3 日每日定时给药，四物汤组灌服四物汤 1ml/只，约合每日每千克体重 3.7g 生药。 考虑治疗组需与模型组对照，第 4 日起每日定时给药，四物汤组灌服四物汤 0.5ml/ 只；乙酰苯肼组灌服自来水 0.5ml/只。 出于同条件考虑，第 5 日起每日定时给药，正常组、环磷酰胺组灌服自来水 0.5ml/ 只。 1 （五）基因表达蛋白含量比较 1. RNA 提取 （1）每组随机抽取一只小鼠，并取其肝组织 50—100mg，剪碎，加入 1mlTorizol 液，快速 电动匀浆； （2 ）22 ℃，静置 5min； （3 ）加入氯仿0.2ml,颠倒 15s； （4 ）22 ℃，静置 3min ； （5 ）离心：4 ℃，10000R/min*15min； （6 ）取上清液0.5ml( 含提取的 RNA ）； （7 ）加入适量异丙醇，混匀； （8 ）22 ℃，静置 10min； （9 ）离心：4 ℃，10000R/min*10min； （10）弃上清液； （11）加入 1ml4 度 75%乙醇（提纯RNA,释放异丙醇）； （12）离心：4 ℃，10000R/min* ５min ； （13）弃上清液，真空干燥5min； （14）用25μl 水溶解，-70℃保存。 2.反转录 5*buffer 4μl DNTP （100mM） 2μl 随机引