DNA和RNA的分离及显色.ppt

实验三 DNA和RNA的提取分离 　　　及颜色反应 一、实验目的 学习用稀碱法从酵母中提取DNA和RNA 利用不同浓度的NaCl溶液分离DNA和RNA 了解核酸的颜色反应 二、实验原理 酵母经稀碱处理可使酵母细胞壁溶解，核酸释放到溶液，再经过滤，溶于液相中的核酸便与菌体残渣分离，此发的优点是简便快速，溶于液相中的核酸含量较高。缺点是RNA在碱性条件下不稳定，容易分解，因此在稀碱中不宜停留过长时间。 利用在不同浓度的NaCl盐溶液中DNA核蛋白与RNA核蛋白的溶解度不同的原理可分离DNA和 RNA。由于RNA核蛋白易溶于0.14 mol/L的NaCl溶液中，而DNA核蛋白难溶于此盐溶液中，这样可通过离心分离使分开。 上清液含有RNA，而沉淀中含有DNA，利用戊糖的颜色反应，就可以鉴定出DNA和 RNA。 显色反应： 核糖与地衣酚（3,5-二羟甲苯）试剂反应呈鲜绿色。脱氧核糖与二苯胺试剂反应生成蓝色化合物，而核糖无此反应。 RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者与3,5-二羟甲苯反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁和氯化铜作催化剂，反应产物在670 nm处有最大吸收。 RNA在20~250微克范围内，光吸收与RNA浓度成正比。地衣酚反应特异性较差，凡是戊糖均有此反应。RNA和其他杂质也能给出类似的颜色。 二苯胺反应根据对去氧戊糖的特异的显色反应进行DNA定量的方法。 其原理是DNA经酸处理，使从嘌呤核苷酸中游离出的去氧核糖在乙醛存在下和二苯胺反应，然后测定反应液的蓝色。由于它不与RNA反应，所以可用来定量测定全核酸中的DNA含量。 三、实验材料 1、材料 干酵母 2、仪器 台式天平 电子天平 沸水浴 离心机 3、器材 普通试管 20 mL×7（干燥） 锥形瓶 100 mL×2 量筒 50 mL×1 移液器 1 mL×3 2 mL× 2 10 mL×1 滴管×2 洗耳球×2 滤纸 漏斗 试管架 移液器架 试管夹 玻棒 四、试剂的配置 1、NaOH 溶液（0.5 N） 取20 g NaOH ，用水溶解并定1000 mL。 2、HCl（1 N） 取83 mL浓盐酸，用水稀释到1000 mL。 3、苔黑酚试剂 将200 mg苔黑酚溶于100 mL浓盐酸中，再加入 100 mg FeCl3.6H2O 4、二苯胺试剂 将1 g二苯胺溶于98 ml冰醋酸中，再加入2 ml浓硫酸（比重1.84）（临用时配置，用前可加几滴乙醛） 五、操作步骤 1、取材 准备称取干酵母2 g，置于100 mL锥形瓶中。 2、碱液浸提 加入20 mL 0.5 N NaOH溶液，用玻棒搅碎酵母，置于沸水浴中加热5分钟 3、过滤 4、分离DNA和 RNA。 颜色反应 1 2 3 4 5 6 RNA核蛋白液（ml) 0.2 0.2 DNA核蛋白（ml) 蒸馏（ml) 0.8 1 0.8 1 苔黑酚（ml) 2 2 二苯胺（ml) 2 2 反应 在通风橱内，沸水浴5分钟 颜色 管号 操作 注意： 地衣酚显色法特异性较差，凡是戊糖均有此反应。因此，测RNA含量时可先测定DNA的含量，再计算出RNA的含量 思考题 1、本实验中分离DNA和 RNA方法的原理是什么？ 2、使用离心机应注意哪些事项？ 3、地衣酚反应中，干扰RNA测定的因素有哪些？如何能够减少它们的影响？ 4、提取RNA过程中为什么要严格控制时间、温度、pH值？ Thanks for your patience!