Ames氏致突变和致癌实验-中国典型培养物保藏中心.PDF

中国典型培养物保存中心 China Center for Type Culture Collection (CCTCC) Ames 氏致突变和致癌实验 实验材料： 菌株：鼠伤寒沙门氏菌突变型 TA97 （CCTCC AB2014173 ），TA98 （CCTCC AB204062 ），TA100 （CCTCC AB204063），TA102 （CCTCC AB2014174 ）； 培养基：LB 培养基，底层葡萄糖基本培养基，表层琼脂培养基（含 10% 0.5mmol 组氨酸/生物素溶液，2ml/ 管）； 溶液、试剂及待测物质：滤纸片，氨苄青霉素溶液（8mg/ml），四环素溶液(8mg/ml)， 结晶紫溶液(1mg/ml)，秋水仙碱，亚硝酸钠，丙烯酰胺，无菌水。 实验步骤： 1.鉴定实验 - （1） 组氨酸营养缺陷（his ）实验 1.1 分别制备底层葡萄糖基本培养基平板和含有 0.5mmol 组氨酸/ 生物素溶液 （0.2ml/皿）的底层葡萄糖基本培养基平板； 2.2 用无菌棉签蘸取TA97、TA98、TA100 和TA102 菌悬液，分别划线接种于含 组氨酸和不含组氨酸的平板上； 2.3 将平板倒置放入37℃培养箱培养48h ，观察菌株生长情况。若菌株只在添加 微量组氨酸的平板上生长，而在不含组氨酸的平板上不能生长，则菌株为 - his 型菌株。 （2）紫外线敏感实验（ΔuvrB 实验） 2.1 制备含有0.5mmol 组氨酸/生物素溶液（0.2ml/皿）的底层葡萄糖基本培养基 平板，用无菌棉签分别蘸取TA97、TA98、TA100 和TA102 菌悬液在平板上 平行划线； 2.2 待菌液浸干后，打开皿盖，用锡箔纸遮盖平板的一半，置于 15W 紫外灯下 照射15s； 2.3 盖上皿盖，置37℃避光培养27h ，观察菌株生长情况。只在未经照射一侧的 平板上生长的菌株为ΔuvrB 型菌株。 （3）抗氨苄青霉素实验（R 因子-抗氨苄青霉素实验）； 3.1 吸取TA97、TA98 、TA100 和TA102 菌悬液0.1ml 分别放入盛有2ml 表层培 养基的试管中（预先加热融化后45℃保温），摇匀后倾倒在底层葡萄糖基本 培养基平板上，并使其分布均匀； 3.2 待琼脂凝固后，将一直径约 1cm 的无菌滤纸片贴在平板上，然后在滤纸片上 滴加8mg/ml 氨苄青霉素溶液20 μl，倒置于37℃培养24h ，观察滤纸片周 围是否出现抑菌环。 （4）抗四环素实验（质粒pAQ1 菌株实验） 4.1 平板制备同3.1 4.2 待琼脂凝固后，将一直径约 1cm 的无菌滤纸片贴在平板上，然后在滤纸片上 滴加8mg/ml 四环素溶液20 μl，倒置于37℃培养24h ，观察滤纸片周围是 否出现抑菌环。 （5）结晶紫敏感实验（深粗糙突变，rfa） 5.1 平板制备同3.1 5.2 待琼脂凝固后，将一直径约 1cm 的无菌滤纸片贴在平板上，然后在滤纸片上 滴加 1mg/ml 结晶紫溶液20 μl，倒置于37℃培养24h ，观察滤纸片周围是 否出现抑菌环。 2.致癌物检测（平板渗入法） （1）制备底层葡萄糖基本培养基平板，置于37℃培养箱中过夜； （2 ）菌液准备：分别挑取适量四种缺陷菌株，接种于 LB 液体培养基中振荡培 9 养10~12h，使菌液浓度达到（1~2）×10 个/ml ； （3）表层培养基试管置于45℃水浴备用，依次加入TA97、TA98、TA100 和TA102 菌悬液0.1ml 和待检测致癌物质0.1ml ； （4 ）表层培养基混匀后，迅速倾倒在底层葡萄糖基本培养基平板上，平放凝固 后，倒置于37℃培养箱48h 后观察结果，计数平板上的回变菌落数。 实验结果： 1.鉴定试验 各菌株的鉴定结果如下： TA97 ：组氨酸缺陷，结晶紫敏感，紫外线敏感，氨苄青霉素不敏感，四环素敏 感； TA98