凯氏定氮法测定蛋白含量原理解析.doc

鲁 洲 集 团 PAGE 4 凯氏定氮法测定蛋白含量原理解析 牛司锋，山东公司品管部 凯氏定氮法是目前蛋白质测定最常用的方法，通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量。由于样品中含有少量非蛋白质含氮化合物，如核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物，因此，此法的结果称为粗蛋白质含量。凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一，可用于所有动、植物食品的分析及各种加工食品的分析，可同时测定多个样品，故国内外应用较为普遍，是个经典分析方法。 凯氏定氮法的原理是食品与浓硫酸、催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据盐酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即可计算出食品中的蛋白质含量。 一、实验试剂 1．40%氢氧化钠溶液：称取40g氢氧化钠溶于60mL蒸馏水中； 2．4%硼酸溶液：称取4g硼酸溶于蒸馏水中稀释至l00mL； 3．0.1mol/L盐酸标准滴定溶液； 4．甲基红次甲基蓝混合指示液：将次甲基蓝乙醇溶液(1g/L)与甲基红乙醇溶液(1g/L)按1+2体积比混合； 5．蒸馏水； 6．硫酸铜； 7．硫酸钾； 8．浓硫酸。 二、实验步骤及相关原理 1．样品处理 称取充分混匀的固体试样0.2~2g、半固体试样2~5g或液体试样10~25g（约相当于30~40mg氮），精确至0.0001g，移入干燥的100mL、250mL或500mL定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜、6g硫酸钾及20mL浓硫酸，轻摇后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热0.5~1h。取下放冷，小心加入20mL水。放冷后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。 同时做试剂空白试验。 在此过程中，主要发生蛋白质与浓硫酸在催化剂作用下进行的氧化分解反应，离子反应方程式为： -NH2＋(浓)H2SO4→(NH4)2SO4…………………………………………………………………（1） 2．定氮装置的检查与洗涤 装好并检查定氮蒸馏装置是否装好，向水蒸气发生器内装水至2/3处，加入数粒玻璃珠或沸石，滴加数滴甲基红指示剂及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生器内的水并保持沸腾。 测定前定氮装置如下法洗涤2~3次：从样品进口入加水适量（约占反应管三分之一体积）通入蒸汽煮沸，产生的蒸汽冲洗冷凝管，数分钟后关闭上方夹子，使反应管中的废液倒吸流到反应室外层，打开下方夹子由橡皮管排出，如此数次，即可使用。 3．碱化蒸馏 向接收瓶内加入10.0mL硼酸溶液，加入混合指示剂2~3滴，并使冷凝管的下端插入液面下，根据试样中氮含量，准确吸取2.0~10.0mL试样处理液由小玻杯注入反应室，以10mL蒸馏水洗涤小玻杯并使之流入反应室内，随后塞紧棒状玻塞。将10.0mL氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸馏10min后移动蒸馏液接收瓶，液面离开冷凝管下端，再蒸馏1min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下蒸馏液接收瓶。 以盐酸标准滴定溶液滴定至终点，其中2份甲基红指示剂与1份亚甲基蓝指示剂，颜色由紫红色变成灰色，pH为5.4；1份甲基红指示剂与5份溴甲酚绿指示剂，颜色由酒红色变成绿色，pH5.1。 同时作试剂空白实验。 在此过程中，主要发生氨气的释放与收集，以及用盐酸标准溶液对接收液的滴定反应，反应方程式为： (NH4)2SO4＋2NaOH＝2NH3＋2H2O＋Na2SO4……………………………………………… （2） 2NH3＋4H3BO3＝(NH4)2B4O7＋5H2O…………………………………………………………（3） (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O＝2NH4Cl+4H3BO3…………………………………………………（4） 4．结果计算 ………………………………………………（5） 式中： X—试样中蛋白质的含量（g/100g）； V1—试液消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积（mL）； V2—试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积（mL）； V3—吸取消化液的体积（mL）； c—硫酸或盐酸标准滴定溶液浓度（mol/L）； 0.0140—1.0mL硫酸[c(1/2H2SO4)＝1.000mol/L]或盐酸[c(HCl)＝1.000mol/L]标准滴定溶液相当的氮的质量（g）； m—样品的质量（g）； F—氮换算为蛋白质的系数。一般食物为6.25；纯乳与纯乳制品为6.38；面粉为5.70