大肠杆菌计数.ppt

大肠杆菌计数 广泛存在于人和温血动物的肠道中，能够在44.5℃发酵乳糖产酸产气、 IMViC生化试验 (靛基质、甲基红、VP试验、柠檬酸盐)为+ + - -或- + - -的革兰阴性杆菌。 大肠杆菌的某些菌株对人有致病性。 相对于大肠菌群和粪大肠菌群，大肠杆菌与粪便污染的相关性最好，应用也最悠久。自1892年被提议作为粪便污染的指示菌以来，已被应用了100多年 。 为什么后来又有了大肠菌群和粪大肠菌群的应用？主要的原因是因为大肠杆菌的检验过于复杂。 大肠杆菌是用于评价食品近期受到粪便污染的指标。 随着食品卫生标准的日益科学和细化，以及对大肠杆菌检验方法的不断改进，对特定食品的大肠杆菌的检验需求肯定会越来越多，因此在本次标准修订时增加了大肠杆菌计数方法。 大肠杆菌计数 第一法：MPN法 第二法： VRBA-MUG平板计数法 第三法：Petrifilm测试片法 第一法 大肠杆菌计数MPN法 大肠杆菌计数MPN法检验程序 初发酵 选择适宜的三个连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液）。每个稀释度接种3管LST肉汤，每管接种1mL（如接种量需要超过1 mL，则用双料LST肉汤）。36℃±1℃培养48h±2h，如所有LST肉汤管均未产气，即可报告大肠杆菌MPN结果。 复发酵 如有产气者，则转接到已提前预温至45℃的EC肉汤管中。将所有接种的EC肉汤管放于带盖的44.5℃±0.2℃水浴箱内，水浴的水面应高于肉汤培养基液面，培养24h±2h，如所有EC肉汤管均未产气，即可报告大肠杆菌MPN结果。 分离培养与纯化 如有产气者，则分别划线接种于伊红美蓝（EMB）平板，36℃±1℃培养24h±2h后检验平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。 挑选典型菌落，如无典型菌落则挑取可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面或平板上，进行进一步的纯化分离。 生化鉴定 取培养物进行革兰氏染色和生化试验。只要有1个菌落鉴定为大肠杆菌，其所代表的LST肉汤管即为大肠杆菌阳性。 查MPN表，报告每g（mL）样品中大肠杆菌MPN值。 EMB琼脂 主要成分：乳糖、营养物质。指示剂系统：伊红和美监。 原理：大肠菌群分解乳糖产酸，使伊红与美蓝结合而形成黑色化合物，故菌落呈黑紫色，并可产生金属光泽。黑色程度与光泽产生情况与伊红、美蓝二者的比例有关。 不发酵乳糖产酸的细菌，在碱性环境中不能使伊红、美蓝结合，因而形成无色的菌落。 部分大肠菌群的菌株在EMB上可形成红色或粉红色的菌落。（应注意非典型的菌落）。 EMB琼脂上大肠杆菌的典型菌与可疑菌落 典型菌落：具黑色中心有光泽或无光泽的菌落。 非典型的可疑菌落：粉红色，无黑心 生化鉴定的注意要点 靛基质试验：36℃±1℃，24h ±2h； 甲基红试验：36℃±1℃，4d；滴加甲基红试剂，出现红色为阳性；出现黄色为阴性结果。 V-P试验： 36℃±1℃，48h ±2h；滴加试剂后若未出现伊红色，应再培养2h后再观察结果。 柠檬酸盐试验： 36℃±1℃，96h ±2h；观察有无细菌生长。有细菌生长培养基可变为蓝色。 第二法 VRBA-MUG平板计数法 制订依据 美国食品药品管理局（FDA）：Bacteriological Analytical Manual ，2002，Chapter 4： Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria 基本原理 4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷，英文缩写 MUG。是一种不产生荧光的底物。由于96%的大肠杆菌都具有葡萄糖醛苷酸酶，能分解β-D葡萄糖醛苷，而使4-甲基伞形酮游离出来，在366nm紫外光下产生蓝色荧光。观察到蓝色荧光即可认为是大肠杆菌阳性。MUG对大肠杆菌的生长繁殖既没有抑制作用也没有促进作用，对菌落形态也没有影响。 VRBA-MUG平板计数法检验程序 检验 选取2～3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度分别取1mL注入两个无菌平皿。 另取1mL样品稀释液注入一无菌平皿中，作空白对照。 将预热至45℃士0.5℃的结晶紫中性红胆盐琼脂10 mL～15mL倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样品匀液充分混匀。 待琼脂凝固后，再加3 mL～4mL VRB-MUG覆盖平板表层。 凝固后翻转平板，36℃±1℃培养18 h～24h。 注：空白对照不加VRB-MUG覆盖。 大肠杆菌平板计数与报告 选择菌落数为10～100的平板，暗室中360nm～366nm波长紫外灯照射下，计数平板上发浅蓝色荧光的菌落。 两个平板上发荧光菌落数的平均数乘以稀释倍数，报告每克(或毫升)样品中大肠杆菌数，以cfu/g(mL)表示。 注意事项 在实验时要用已知MUG阳性菌株（如大肠杆菌ATCC2592