实验九真核细胞RNA的制备.ppt

实验九 真核细胞RNA的制备 Trizol 法提取组织或培养细胞总RNA 实验背景知识 哺乳动物中，平均每个细胞大约含有10-5ugRNA。所分离出的RNA主要有以下几类分子组成：rRNA（占RNA总量的80%～85%），tRNA和核内小分子RNA（占10%～15%），mRNA（占1%～5%）。其中rRNA在总RNA分子中含量丰富，由28S、18S、5.85S及5S几类组成，它们之间同源性大、分子量变化不大，所以可根据它们的密度和分子大小，通过密度梯度离心，凝胶电泳或离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，细胞中含量少，3’端存在20～230个多聚腺苷酸poly(A)。利用此特征，可很方便地从总RNA中，用寡聚（dT）亲和层析柱分离mRNA。mRNA分子群体编码细胞内所有的多肽和蛋白质，因而是分子生物学中重要的研究对象。 分离纯净、完整的RNA对于分子克隆的实验是很重要的，而且是进行基因表达分析的基础。来源于任何细胞的RNA都可以拷贝成双链DNA，并克隆化，最终获得相应于特定细胞来源的cDNA文库。对RNA结构和生物合成的分析有助于基因表达的研究。Northern印迹及杂交分析、寡聚（dT）纤维素选择分离mRNA、cDNA合成及体外翻译等实验的成败很大程度上决定于RNA的质量。 在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染，RNA酶很稳定，一般而言反应不需辅助因子，RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类，它耐热、耐酸、耐碱，蛋白质变性剂可使之暂时失活。RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起严重的后果。 RNA分离的最关键因素是尽量避免RNA酶的污染。创造一个无RNase的环境是提取RNA至关重要的因素。实验中所用到的全部溶液、玻璃器皿、塑料制品都需特别处理。一方面避免外源RNase的污染。要做到如下几点：①操作戴口罩和手套；②实验室保持洁净；③玻璃器皿须用0.1%二乙基焦碳酸盐（DEPC）浸泡处理，并高压灭菌，250℃烘干4小时以上（高压不能完全灭活RNase）；④所有溶液（除Tris外）须经DEPC浸泡处理；⑤实验中所有塑料器材最好灭菌后一次性使用，所有化学试剂用新包装。另一方面排除内源RNase污染。内源RNase是由组织细胞中携带，细胞破碎后即释放出来。因而力争在提取的起始阶段对RNase活力进行有效抑制，主要方法是使用RNase抑制剂，常用的有盐酸胍、异硫氰酸胍、RNase阻抑蛋白（RNasin）和氧钒核糖核苷复合物等。 所有分离提取RNA的方案的第一步操作都是在能导致RNA酶变性的化学环境中裂解细胞，然后才将RNA从各种生物大分子中分离出来。决定采用何种合适的制备方法，取决于RNA的细胞来源及其最终用途。本实验介绍从真核细胞中提取总RNA的通用方法，细胞用异硫氰酸胍裂解，此过程操作较少，从许多来源都能获得纯净的RNA，是从高内源性RNA酶的组织中提取RNA的首选方法。 一、实验目的和原理 掌握真核细胞RNA提取方法 ： RNA是一种极易降解的核酸分子，存在于细胞质和胞核中。利用高浓度强变性剂异硫氰酸胍可使细胞结构迅速被破坏，使RNA从细胞中释放出来，同时亦使RNA分子从核糖体蛋白中解离下来。高浓度异硫氰酸胍和β-－巯基乙醇还使细胞内的各种RNA酶失活，使释放出的RNA不被降解。十二烷基肌氨酸钠是一种离子型去污剂，能解离RNA上的核蛋白和抑制RNA酶活性，不容易析出沉淀。细胞裂解后存在于裂解溶液内的有RNA、核DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA与其它细胞组分分离出来，得到纯化的总RNA。 掌握逆转录聚合酶链反应的基本原理、实验基本条件 ; 熟悉PCR反应条件的优化和注意事项，PCR引物设计的基本原则，定量PCR的原理和用途。 二、实验材料 组织细胞：新鲜动物肝脏 塑料制品： 尽可能使用无菌、一次性塑料制品，已标明 RNase-Free 的塑料制 品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下： 1．在玻璃烧杯中注入去离子水，加入 DEPC（焦碳酸二乙酯） 使 DEPC 的终浓度为 0.1%。注意：DEPC 为剧毒物，活性很强，小心在通 风柜中使用。 2．处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入 DEPC 水溶液， 使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。 3．在通风柜中室温处理过夜。 4．将 DEPC 水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住DEPC 水处理 过的塑料制品的烧杯，70～80℃烘拷干燥，高温高压蒸气灭菌至少 30 分钟。 5．烘箱用合适的温度（70～