胶体金学术交流20091227.ppt

免疫层析快速诊断技术 Lateral-Flow Diagnostic Technology 军事医学科学院 军事兽医研究所 王铁成 胶体金技术的应用的领域 胶体金简介 胶体金，一般指金的水溶液，又称金溶胶。 金以微小的粒子分散在水中所形成的金 溶胶，其中分散的金颗粒直径在1~100nm 之间。 柠檬酸三钠还原法（微波法） 取处理过的250mL三角瓶，加99mL三馏水及1mL 1%氯化金，用锡箔封口，放入微波炉中 ，用高火加热3min；此时溶液沸腾；取出三角瓶，拿下锡箔迅速向三角瓶内加入1.6mL新配制的柠檬酸三钠，边加边摇匀，再次用锡箔封三角瓶口，放入微波炉中，用中高火加热3min，待其自然冷却至常温，再用过滤的三馏水补回原体积，4℃封口保存。 胶体金探针的制备 胶体金探针的制备 胶体金标记蛋白 试纸条的结构示意图 结合释放垫的处理 糖的作用 大分子物质的作用(BSA等） 缓冲液的选择 干燥方法 干燥方法的比较 1.冷冻干燥法 2. 烘箱 温湿度的控制 1.温度对蛋白的影响 2.湿度的控制办法 在检测鼠脑及犬唾液中的应用 样品处理液：10mmol pH7.2 PBS或生理盐水 研磨后2000r/min 8min，取上清即可进行检测 实验二 狂犬病毒抗体检测试纸的制备 反应原理 不完全定量实验 方法：（用本试纸条需用本室制备的样品稀释液） 1 .用已知犬RV阳性血清，2倍倍比稀释，初步判断其最高稀释倍数时的效价，并记录大约0.5IU时的显色状况； 2.未知犬RV阳性血清，2倍倍比稀释，观察其显色强度能达到0.5IU时犬血清的稀释倍数，乘以其稀释倍数，即约为所测血清的效价。 抗体检测试纸下一步工作 1.虽然用检测试纸精确定量血清效价十分困难，但在本试纸的实验中，能够粗略测定血清效价，而且仍有提升的可能； 2.阴性血清测定过程中，当稀释至64倍—128之间时，有很弱的假阳性（不影响判定），需要改进部分组件； 3.实验室的实验方法转化到生产的瓶颈也要考滤； 4.试纸条生产操作人员的不同，会景响到产品的质量。 材料选择 各成分的作用 1.缓冲溶液的作用 (PH) 2.盐的作用 3.大分子蛋白BSA\PVP 4.表面活性剂 Tween-20,TritonX-100 样品垫的处理 组装完成的检测试纸 生理盐水 DMEM CDV CPV CCV RV阳性 样品 检测试纸的特异性检测 灵敏度检测结果(RV Vero细胞培养液) 阴性对照结果 (Vero细胞培养液) 试纸条灵敏度的检测 鼠脑检测结果 RV阴性鼠脑 RV阳性鼠脑 兔抗RV SPA 金标记RV 犬狂犬阳性和阴性血清检测结果 犬RV阴性血清 犬RV阳性血清 从右至左稀释倍数为 2 4 8 16 32 64 * * * * 一. 概述 1971年 Faulk和Taylon 用兔抗沙门氏菌抗血清与胶体金颗粒结合, 制备成金标抗体, 检测细菌表面抗原的分布； 1975年 Horisberger等把胶体金技术推广应用于扫描电镜、透射电镜及冰冻蚀刻电镜的研究； 1978年 Geoghegan 发表了胶体金标记物在光镜水平的应用； 1981年Danscher建立了用银显影液增强光镜下金颗粒可见性的免疫金银染色法（Immunogold—sliver staining, IGSS）； 1986年Fritz等人在免疫金银法基础上成功地进行了彩色免疫金银染色，使得结果更加鲜艳夺目； 近十多年，胶体广泛应用于各领域如下图 农兽药残留（磺胺类、瘦肉精等）,大肠杆菌,黄曲霉素 食品安全检测中心,各监管部门 食品安全 有害物质超标 环保监测部门，研究机构 环境 病毒（烟草花叶病毒、犬细小病毒等） 细菌、寄生虫（鼠疫耶尔森菌、弓形虫等） 畜牧兽医站，商检系统，边检口岸，农牧类院系和研究所 农牧业 毒品（吗啡，K粉，摇头丸，冰毒） 女性妊娠【hCG(早孕)，LH，FSH】 标志物（AFP、肌钙蛋白、粪便血红蛋白等） 传染病（乙肝五项，HIV，SARS等） 各级医院，血站，CDC，防疫站，诊断中心；家庭自检；商检系统；边检口岸；公安系统 人类医学 检测的物质 应用领域 类别 定量问题 灵敏度问题 快速：全部检测过程仅需 5-20分钟。 简便：不需其它任何仪器设备，操作也极其简单，无需专业人员，携带方便，可随时随地进行。 廉价：单个测试条成本较低 可单份检测：对标本既能成批检测，又可单份检测，可很快拿到结果。 稳定性好：金标试剂稳定，可长期保存。 检测标本种类多：既可用于查血，又可用于