根癌农杆菌的高效电激转化.pdfVIP

维普资讯 第 4l卷 第 6期 武汉大学学报 (自然科学版 ) Vo1．41 N0．6 l995年 12jJ J．WuhanUniv．(NaturalScienceEdition) Dec．1995 ] ] 根癌农杆菌的高效电激转化 』J 施华 中_ 杨弘远 周 嫦 (武汉大学生命科学学院，武汉 ，430072) 陈正华V (中国科学院遗传研究所，北京 ，100101) rr、、 摘要 利用电激泼将双元载体质粒 pBl121导人根癌农杆菌 AGL一1并莸得较高转化效率 ． 探讨 了不 同电激条件对转化效率的影响 ，并捡测 了CaMV35S启动子启动 GUS基 因在根癌农杆菌 中的表达 ．结果表明：根癌农杆 菌电激转化的最适 电激条件为 11kV!cm，21．5 ，电场强度是影 响转化效率的关键因索 ．当质粒 DNA浓度从 0．2mg／L增加至 0．6mg／L时，转化效率呈线性增 加 ．细菌密度对转化效率也有一定影响 ．最高转化效率为每 g质粒 DNA1．7×10j转化子 ．组 织化学反应证实CaMV35S能启动GUS基因在根癌农杆菌中表达 ． 莘中詈圉法分分类誊号’Q7t19’ 电U濑l。，，、杆1菌奇l泣 将含 目的基因的重组质粒导入根癌农杆菌，是利用农杆菌介导法进行植物遗传转化的重 要前提 ．传统的导入方法主要是三亲交配法 ”和冻融法0．三亲交配法导入效率较高 ，但必须 在协助质粒的作用下完成 一过程繁琐费时；冻融法导入效率低且受较多因素的影响 ．近年应用 电激法转化细菌 已有报道。 ，尤其在大肠杆菌的转化方面进行 了详细研究并获得了很高的 ． 转化效率 ，但应用 电激法将外源质粒导入农杆菌的报道较少 ．我们利用高压 电脉冲使农 杆菌细胞瞬间穿孔 ，成功地将双元载体质粒 pBI121导入根癌农杆菌细胞并获得较高的转化 效率 ，并探讨 了影响转化效率 的因素 ． 既 1 材料和方法 1．1 农杆菌制备 挑取根癌农杆菌AGL一1 (含氨苄青霉素抗性)单菌落接种于 150mL含 60mg／L氨苄 青霉素的 2×YT培养基 (1．6 tryptone，1 yeastextract，0．5 NaCI，pH7．。)中，28C，225 r／rain振荡培养约 30h-4C 5000r／rain离心 10min收集细菌，然后按下述方法洗涤以便降 低悬浮液 的离子强度 ：沉淀重悬于 150mL蒸馏水 中，离一L-收集 ；重悬于 50mL蒸馏水中．离 心收集；重悬于1omL1O 甘油 中，离心收集 ；最后将细菌重悬于4mL10 甘油中，分装 收稿 日期：199502i0 施华 中：男．28岁．博士．主要从事植物生殖生物学研究 国家 自然科学基盘贷助的渫题 维普资讯 第 6期 施华中等 ：根癌农杆菌的高放电激转化 一 2O℃保存 ． 碱裂解吴法提提取取雁质粒粒pBl121((含含卡卡那那霉霉素素抗抗性性基基因因)一，，RNNAA酶醇I除篆舌去RNAA，’酚抽往提除苎去 蛋 白质 ，质粒 DNA溶于 TE缓冲液 中，分装后一20c保存 ．琼脂糖 电泳法检测 D A纯度 ，紫