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液相层析系统示意图 缓 冲 液 梯 度 制 造 器 泵 记录器 监 视 器 管 柱 胶 体 胶 体 裝 填 收 集 器 (1) (2) (3) (4) (5) reservoir 转 接 器 EXP5 SDS分析蛋白质及超声乳化 实验仪器设备 SDS装置、制冰机、超声波破碎仪 实验步骤 1.SDS分析蛋白质，泳道分别为分子marker、透析后样品、凝胶层析后样品。 2.将凝胶层析后蛋白收集，按1：1比例与矿物油混合，冰浴下置于超声波破碎仪进行超声乳化，超声波设置为80w，每次工作每10s间隔5s，20次一个循环，5个循环。 SDS的基本原理 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。 SDS非极性尾部 极性头部 SDS boiling 变性蛋白质成一线状分子 天然蛋白质 并且均勻带上一层负电荷 X Y Z + SDS NativeSDS分子量 及 净电荷密度、 分子形状均影响泳动率 只有 分子量 影响泳动率 X Y Z - + SDS为不连续电泳 不连续电泳 凝胶孔径大小、缓冲液成分和pH值均为不连续的电泳。 样本胶 浓缩胶 分离胶 SDS凝胶体系的组成 1 电泳系统 pH 胶体浓度 缓冲液 上层 (负极) 缓冲液 2 样本溶液 3 浓缩胶 6.9 4 分离胶 胶 体 5 下层 (正极) 缓冲液 Tris-HCl Tris-HCl Tris-glycine Tris-glycine Tris-glycine 8.3 8.3 8.3 8.3 5% 5 - 20% - - - ● 胶体的不连续性有利于产品的浓缩 SDS对被分离样本的浓缩作用 分离胶 浓缩胶 样本 8.9 6.9 离子缺乏空间 A B C + + 8.3 蛋白质微型SDS电泳系统 SDS实验步骤 1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干。 2.把玻璃板在灌胶支架上固定好，固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板。 3.按比例配好分离胶，用移液管快速加入，大约5厘米左右，之后加少许蒸馏水，静置40分钟。凝胶配制过程要迅速，催化剂TEMED要在注胶前再加入，否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成，避免产生气泡。水封的目的是为了使分离胶上延平直，并隔绝空气。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。 4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干，按比例配好浓缩胶，连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处。迅速插入样梳，静置40分钟。样梳需一次平稳插入，梳口处不得有气泡，梳底需水平。 5. 在上槽内加入缓冲液后，拔出样梳。要使锯齿孔内的气泡全部排出，否则会影响加样效果。 6.加样。 7.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳。 8.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。 9.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。 蛋白亚单位疫苗的制作-佐剂 佐剂（adjuvant）是指能够增强免疫应答或改变免疫应答类型的物质，应用时可与抗原同时或预先注射于机体。佐剂本身可以有免疫原性，也可以没有免疫原性。应用佐剂的目的是为了提高抗原对机体的免疫原性，从而提高抗体的效价。 佐剂的作用及特点 1、增加抗原的表面积，并改变抗原的活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性； 2、佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织的存留时间，减低抗原的分解速度，使抗原缓慢释放至淋巴系统中，持续刺激机体产生高滴度的抗体； 3、佐剂可以直接或间接激活免疫活性细胞并使之增生，从而增强了体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫功能； 4、良好的佐剂应具有无毒性或副作用低的特点。 常用佐剂的种类 佐剂主要可分为两种：一种本身具有免疫原性，如百日咳杆菌、抗酸杆菌（结核分枝杆菌）以及革兰阴性杆菌等；另一种本身无免疫原性，如氢氧化铝、磷酸钙、矿物油乳剂、表面活性剂等。目前应用最多的是弗氏佐剂（Freund adjuvant）。 蛋白亚单位疫苗的制作-弗氏佐剂 弗氏不完全佐剂 矿物油/植物油、乳化剂（吐温80等） 弗氏完全佐剂 在弗氏不完全佐剂的基础上加卡介苗或